MONITORUL OFICIAL AL ROMANIEI

 

P A R T E A  I

Anul XIV - Nr. 556         LEGI, DECRETE, HOTĂRÂRI SI ALTE ACTE         Marti, 30 iulie 2002

 

SUMAR

 

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE

ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

 

105. - Ordin al ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor pentru aprobarea Normei sanitare veterinare cu privire la conditiile de sănătate a animalelor si certificarea veterinară pentru importul din tări terte de material seminal provenit de la bovine

 

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

 

MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PĂDURILOR

 

ORDIN

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare cu privire la conditiile de sănătate a animalelor si certificarea veterinară pentru importul din tări terte de material seminal provenit de la bovine

 

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pădurilor,

în temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitară veterinară nr. 60/1974, republicată, cu modificările si completările ulterioare,

în baza Hotărârii Guvernului nr. 12/2001 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Pădurilor, cu modificările si completările ulterioare,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.704 din 25 februarie 2002, întocmit de Agentia Natională Sanitară Veterinară,

emite următorul ordin:

Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară veterinară cu privire la conditiile de sănătate a animalelor si certificarea veterinară pentru importul din tări terte de material seminal provenit de la bovine, prevăzută în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. - Directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. - Agentia Natională Sanitară Veterinară va controla modul de aducere la îndeplinire a prevederilor prezentului ordin.

Art. 4. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, si va intra în vigoare în termen de 15 zile de la data publicării lui.

 

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pădurilor,

Ilie Sârbu

 

Bucuresti, 11 martie 2002.

Nr. 105.

 

ANEXĂ

 

NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ

cu privire la conditiile de sănătate a animalelor si certificarea veterinară pentru importul din tări terte de material seminal provenit de la bovine

 

Art. 1. - Autoritatea sanitară veterinară centrală a României avizează importul de material seminal provenit de la bovinele care îndeplinesc conditiile stabilite în certificatele de sănătate a animalelor prevăzute în anexele nr. 1-4.

Art. 2. - Tările terte autorizate să utilizeze modelul de certificat de sănătate a animalelor prevăzut în anexa nr. 1 sunt: Republica Cehă, Ungaria, Noua Zeelandă, Polonia, România, Elvetia si Republica Slovacă.

Art. 3. - Tara autorizată să utilizeze modelul de certificat de sănătate a animalelor prevăzut în anexa nr. 2 este Statele Unite ale Americii.

Art. 4. - Tara autorizată să utilizeze modelul de certificat de sănătate a animalelor prevăzut în anexa nr. 3 este Canada, excluzând regiunea văii Okanagan din Columbia Britanică, care este definită ca zona delimitată de o linie trasată de la un punct aflat pe granita care separă Canada de Statele Unite ale Americii, de 120ş15’ longitudine, 49ş latitudine îndreptată spre nord, către un punct de 119ş35’ longitudine, 50ş30’ latitudine, într-o directie nord-est către un punct de 119ş longitudine, 50ş45’ latitudine, într-o directie sudică spre un punct aflat pe granita care separă Canada de Statele Unite ale Americii, de 118ş15’ longitudine si 49ş latitudine.

Art. 3. - Tara autorizată să utilizeze modelul de certificat de sănătate a animalelor prevăzut în anexa nr. 4 este Australia.

Art. 4. - Testarea bovinelor pentru febra catarală si pentru boala hemoragică epizootică se va efectua conform protocoalelor prevăzute în anexa nr. 5.

Art. 5. - Anexele nr. 1-5 fac parte integrantă din prezenta normă sanitară veterinară.

 

ANEXA Nr. 1

la norma sanitară veterinară

 

CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR

pentru importul de material seminal provenit de la bovine

 

1. Expeditor (numele si adresa completă) Numărul certificatului

2. Tara tertă a colectării

3. Destinatar (numele si adresa completă)

4. Autoritatea sanitară veterinară competentă

5. Autoritatea sanitară veterinară competentă locală

6. Locul încărcării

7. Numele si adresa centrului de colectare a materialului seminal

8. Mijlocul de transport a materialului seminal

9. Locul si tara de destinatie

10. Numărul sigiliului containerelor cu material seminal

11. Numărul de autorizare a centrului de colectare

12. Identificarea materialului seminal proaspăt sau congelat*)

a) Numărul de doze b) Data (datele) colectării c) Rasa

d) Identificarea animalului donator.


*) A se anula, după caz.

13. Subsemnatul ..........., medic veterinar oficial, am citit si îmi este cunoscută Directiva Consiliului 88/407/CEE si certific că: a) ...............................................................................................

(denumirea tării exportatoare) a fost indemnă de pestă bovină si febră aftoasă pe o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export si până la data de expediere a sa, în cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli;

b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fostcolectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost:

(i) autorizat conform conditiilor stabilite în cap. I din anexa A la Directiva Consiliului 88/407/CEE;

(ii) condus si supravegheat conform conditiilor stabilite în cap. II din anexa A la Directiva Consiliului 88/407/CEE;

(iii) indemn de rabie, tuberculoză, bruceloză, antrax si pleuropneumonia contagioasă bovină pe o perioadă de 30 de zile înainte de data colectării materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile după data colectării (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii);

c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal:

(i) provin din efective si/sau au fost fătate de mame care îndeplinesc conditiile prevăzute la cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE;

(ii) au fost supuse, înainte de a intra în izolare, testelor solicitate conform cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE;

(iii) au respectat cerintele de izolare înainte de intrare si pe cele de testare stabilite conform cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE;

(iv) au fost tinute cel putin un an si au fost supuse testelorde rutină conform cap. II din anexa B la Directiva 88/407/CEE;

(d) materialul seminal ce trebuie exportat:

(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti în

.................................................................................................  (denumirea tării exportatoare)

o perioadă de 6 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export si care satisfac conditiile stabilite în anexa C la Directiva 88/407/CEE;

(ii) a fost obtinut de la donatori care:

1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginita pustuloasă infectioasă1); sau

2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginita pustuloasă infectioasă, efectuat într-o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau  1) Se anulează, după caz.

3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati în concordantă cu cap. II din anexa B la Directiva Consiliului 88/407/CEE si având un rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat înainte de vaccinare în centrul de colectare a materialului seminal aprobat;

(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat în conditii care

îndeplinesc prevederile Directivei 88/407/CEE.

 

Întocmit la ............................................................................ (locul), la .......................................................................................................  (data)

 

Semnătura1) .................................................................................

Numele si prenumele (cu majuscule) ......................................

Stampila1)

Titlul oficial ..................................................................................


1) Semnătura si stampila trebuie să fie de o culoare diferită de cea a tipăriturii.

 

ANEXA Nr. 2

la norma sanitară veterinară

 

CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR

pentru importul de material seminal provenit de la bovine din Statele Unite ale Americii

 

1. Expeditor (numele si adresa completă)

Numărul certificatului

2. Tara tertă a colectării

3. Destinatar (numele si adresa completă)

4. Autoritatea sanitară veterinară competentă

5. Autoritatea sanitară veterinară competentă locală

6. Locul încărcării

7. Numele si adresa centrului de colectare a materialului seminal

8. Mijlocul de transport

9. Locul si tara de destinatie

10. Numărul sigiliului containerelor cu material seminal

11. Numărul de autorizare a centrului de colectare a materialului seminal

12. Identificarea materialului seminal proaspăt sau congelat*)

a) Numărul de doze

b) Data (datele) colectării

c) Rasa

d) Identificarea animalului donator


*) A se anula, după caz.

 

13. Subsemnatul ............, medic veterinar oficial, am citit si îmi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 111 din 11 februarie 2002, si certific că:

a) ............................................................................................... (denumirea tării exportatoare) a fost indemnă de pestă bovină si febră aftoasă într-o perioadă de 12 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export si până la data de expediere a sa si în cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli;

b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fost colectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost:

(i) autorizat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) condus si supravegheat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iii) indemn de rabie, tuberculoză, bruceloză, antrax si pleuropneumonia contagioasă bovină pe o perioadă de 30 de zile înainte de data colectării materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile după colectare (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii);

c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal:

(i) provin din efective si/sau au fost fătate de mame care îndeplinesc conditiile prevăzute de Ordinul ministrului

agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) au fost supuse, înainte de a intra în izolare, testelor prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iii) au respectat cerintele de izolare înainte de intrare si pe cele de testare stabilite în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iv) au fost tinute cel putin un an si au fost supuse testelor de rutină conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

d) materialul seminal ce trebuie exportat:

(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti în .................................................................................................  (denumirea tării exportatoare) o perioadă de 6 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export, si care îndeplinesc conditiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

i(ii) a fost obtinut de la donatori care:

1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginita pustuloasă infectioasă1); sau

2. reactionează negativ la un test de seroneutralizare sau un test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginită pustuloasă infectioasă, efectuat într-o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau

3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001 si având un rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat înainte de vaccinare în centrul de colectare a materialului seminal aprobat; 

1) Se anulează, după caz.

(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iv) a fost obtinut de la tauri donatori care au fost supusi de două ori, la interval de cel mult 12 luni, înainte si după colectare, la următoarele teste, cu rezultate negative, într-un laborator autorizat (testarea după colectare trebuie să fie efectuată pe o probă de sânge prelevată cu nu mai putin de 21 de zile după colectarea materialului seminal pentru export):

1. un test Elisa competitiv pentru febra catarală, conform anexei nr. 5 la prezenta normă sanitară veterinară;

2. un test de imunodifuzie în gel de agar conform anexei nr. 5 la prezenta normă sanitară veterinară si un test de neutralizare pentru toate serotipurile virusului bolii hemoragice epizootice cunoscute ca existând în tara exportatoare.

 

            Întocmit la .............................................................................. (locul), la  ...................................................... (data)

 

Semnătura1) .................................................................................

Numele si prenumele (cu majuscule) ........................................

Titlul oficial .................................................................................

Stampilă1)


1) Semnătura si stampila trebuie să fie de o culoare diferită de cea a tipăriturii.

 

ANEXA Nr. 3

la norma sanitară veterinară

 

CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR

pentru importul de material seminal provenit de la bovine

 

1. Expeditor (numele si adresa completă) Numărul certificatului

2. Tara tertă a colectării

3. Destinatar (numele si adresa completă)

4. Autoritatea sanitară veterinară competentă

5. Autoritatea sanitară veterinară competentă locală

6. Locul încărcării

7. Numele si adresa centrului de colectare a materialului seminal

8. Mijlocul de transport 9. Locul si statul membru de destinatie a materialului seminal

10. Numărul sigiliului containerelor cu material seminal

11. Numărul de autorizare a centrului de colectare

12. Identificarea materialului seminal proaspăt sau congelat*)

a) Numărul de doze b) Data (datele) colectării c) Rasa

d) Identificarea animalului donator


*) A se anula, după caz

 

13. Subsemnatul ............., medic veterinar oficial, am citit si îmi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 111 din 11 februarie 2002, si certific că:

a) ........................................................................................... (denumirea tării exportatoare) a fost indemnă de pestă bovină si febră aftoasă într-o perioadă de 12 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export si până la data de expediere a sa si în cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli;

b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fost colectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost;

(i) autorizat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) condus si supravegheat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iii) indemn de rabie, tuberculoză, bruceloză, antrax si pleuropneumonia contagioasă bovină o perioadă de 30 de zile înainte de data de colectare a materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile după colectare (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii);

c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal:

(i) provin din efective si/sau au fost fătate de mame care îndeplinesc conditiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) au fost supuse, înainte de a intra în izolare, testelor prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iii) au respectat cerintele de izolare înainte de intrare si pe cele de testare prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iv) au fost tinute pentru cel putin un an, au fost supuse testelor de rutină, conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001 si cap. II din anexa B la Directiva 88/407/CEE;

d) materialul seminal ce trebuie exportat:

(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti în ................................................................................................ (denumirea tării exportatoare) o perioadă de 6 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export si care îndeplinesc conditiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) a fost obtinut de la donatori care:

1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginita pustuloasă infectioasă1); sau

2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginita pustuloasă infectioasă, efectuat într-o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau

3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001, având un rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat înainte de vaccinare, în centrul de colectare a materialului seminal aprobat;

(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iv) a fost obtinut de la tauri donatori care, fie:

1. se găseau în centrul autorizat de colectare a materialului seminal la data de 1 iulie 1994; fie

2. au fost introdusi în centrul autorizat după data de 1 iulie 1994, fiind supusi, cu rezultate negative, următoarelor teste pentru febra catarală si boala hemoragică epizootică, într-un laborator autorizat, înainte de a intra în centru si în orice caz au fost supusi semestrial, cu rezultate negative, următoarelor teste, într-un laborator autorizat:

- test Elisa competitiv pentru febra catarală conform anexei nr. 5 la prezenta normă sanitară veterinară;

- test de imunodifuzie în gel de agar, conform anexei nr. 5 la prezenta normă sanitară veterinară si test de neutralizare pentru toate serotipurile virusului bolii hemoragice epizootice găsite în tara exportatoare.

Întocmit la .............................................................................. (locul), la ....................................................... (data)

 

Semnătura2) .........................................................................

Numele si prenumele (cu majuscule) ................................

Titlul oficial ...........................................................................

Stampilă2)


1) Se anulează, după caz.

2) Semnătura si stampila trebuie să fie de o culoare diferită de cea a tipăriturii.

 

ANEXA Nr. 4

la norma sanitară veterinară

 

CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR

pentru importul de material seminal provenit de la bovine

 

1. Expeditor (numele si adresa completă) Numărul certificatului

2. Tara tertă a colectării

3. Destinatar (numele si adresa completă)

4. Autoritatea sanitară veterinară competentă

5. Autoritatea sanitară veterinară competentă locală

6. Locul încărcării

7. Numele si adresa centrului de colectare a materialului seminal

8. Mijlocul de transport a materialului seminal

9. Locul si statul membru de destinatie

10. Numărul sigiliului containerelor cu material seminal

11. Numărul de autorizare a centrului de colectare

12. Identificarea materialului seminal proaspăt sau congelat*)

a) Numărul de doze b) Data (datele) colectării c) Rasa

d) Identificarea animalului donator


*) A se anula, după caz.

 

13. Subsemnatul, .........., medic veterinar oficial, am citit si îmi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001 si certific că:

a) ........................................................................................... (denumirea tării exportatoare) a fost indemnă de pestă bovină si febră aftoasă într-o perioadă de 12 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export si până la data de expediere a sa si în cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli;

b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fost colectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost:

(i) autorizat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) condus si supravegheat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iii) indemn de rabie, tuberculoză, bruceloză, antrax si pleuropneumonia contagioasă bovină o perioadă de 30 de zile înainte de data colectării materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile după colectare (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii);

c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal:

(i) provin din efective si/sau au fost fătate de mame care îndeplinesc conditiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) au fost supuse, înainte de a intra în izolare, testelor prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iii) au respectat cerintele de izolare înainte de intrare si pe cele de testare, prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iv) au fost tinute cel putin un an si au fost supuse testelor de rutină, conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

d) materialul seminal ce trebuie exportat:

(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti în ........................................................................................... (denumirea tării exportatoare) o perioadă de 6 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export si care îndeplinesc conditiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(ii) a fost obtinut de la donatori care:

1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginita pustuloasă infectioasă1); sau

2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa pentru rinotraheita infectioasă bovină/vulvovaginita pustuloasă infectioasă, efectuat pe perioada a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau

3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati, conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001, având rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat în centrul aprobat de colectare a materialului seminal înainte de vaccinare;

(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 353/2001;

(iv) a fost obtinut de la tauri donatori care au fost supusi de două ori, la interval de cel mult 12 luni, înainte si după colectare, la următoarele teste, cu rezultate negative, într-un laborator autorizat (testul în urma colectării trebuie să fie efectuat pe o probă de sânge prelevată cu nu mai putin de 21 de zile după colectarea materialului seminal pentru export):

1. un test Elisa competitiv pentru febra catarală, conform anexei nr. 5 la prezenta normă sanitară veterinară;

2. un test de imunodifuzie în gel de agar, conform anexei nr. 5 la prezenta normă sanitară veterinară si un test de neutralizare pentru toate serotipurile virusului bolii hemoragice epizootice cunoscute ca existând în tara exportatoare.

3. un test seroneutralizare pentru virusul Akabane.

 

            Întocmit la .............................................................................. (locul), la ................................................ (data)

 

Semnătura2) .................................................................................

Numele si prenumele (cu majuscule) ......................................

Titlul oficial ..............................................................................

Stampilă2)

 


1) Se anulează, după caz.

2) Semnătura si stampila trebuie să fie de o culoare diferită de cea a tipăriturii.

 

ANEXA Nr. 5

la norma sanitară veterinară

 

PROTOCOL

pentru un test Elisa competitiv “test de imunoabsorbtie cu legătură enzimatică”, test utilizând anticorpi monoclonali

specifici de grup pentru detectarea anticorpilor virusului febrei catarale

 

Test competitiv Elisa pentru febra catarală, utilizând anticorpul monoclonal 3-17-A3

Testul este capabil să detecteze anticorpi fată de toate serotipurile cunoscute ale virusului febrei catarale “VFC”.

Principiul testului este întreruperea reactiei dintre antigenul VFC si un anticorp monoclonal specific de grup “3-17-A3” prin adăugarea de dilutii ale serului de testat. Anticorpii VFC prezenti în serul de testat blochează reactivitatea anticorpului monoclonal “AcM” si rezultă o atenuare a schimbării asteptate a culorii în momentul adăugării substratului enzimatic.

Materiale si reagenti

1. Plăci de microtitrare cu fund plat

2. Antigen: preparat în modul descris mai jos

3. Tampon de blocare: lapte praf deshidratat “Marvel” 5% “w/v”, Tween-20 0,1% “v/v” “furnizat ca solutie de polioxietilenă sorbiton monolaurat” în solutie salină tamponată – fosfat “PBS”

4. Anticorp monoclonal 3-17-A3 “furnizat ca supernatant de cultură tisulară hibridomă” depozitat la temperatura de -20şC sau liofilizat, diluat 1/50, cu tampon de blocare înainte de utilizare, dirijat contra polipeptidei p7 specifică de grup

5. Conjugat: globulină de iepure antisoarece “absorbită si eluată”, conjugată cu peroxidază de hrean si păstrată la întuneric la temperatura de 4şC

            6. Substrat si cromogen: 0,2 g de ortofenilen-diamină “OFD” dizolvată într-un tampon constând în 2,553 g acid citric si 4,574 g di-sodium hidrogenortofosfat adus la 500 ml cu apă distilată, împărtită în cote-părti de 25 ml si păstrată la întuneric la temperatura de -20şC, cu 12 μl/25 ml de peroxid de hidrogen “30% w/v” adăugat imediat înainte de utilizare A se manipula OFD cu precautii - a se purta mănusi din cauciuc - suspect de a fi mutagen

7. Acid sulfuric 1 M: 26,6 ml de acid adăugat la 474,4 ml apă distilată

Atentie - Întotdeauna se adaugă acid în apă, niciodată apă în acid

8. Agitator orbital

9. Cititor de plăci Elisa - testul poate fi citit vizual

 

Protocol de testare

 

Martor

H

G

F

E

D

C

B

A

1

Controlul AcM

Controlul pozitivelor

 

 

Antigen + conjugat

 

 

2

 

 

 

 

 

3

Antigen + ser pozitiv + AcM + conjugat

 

 

 

1/2

 1/4

1/8

1/16

1/32

 1/64

1/128

 1/256

 

 

Seruri de testat

 

 

1/2

1/4

1/8

1/16

1/2

 1/4

 1/8

1/16

4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

Seruri de testat

 

 

 

 

 

 

 

 

7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12

 

Protocol de testare

 

Controlul martorului

Rândul 1A-H reprezintă un control al martorului constând în antigen VFC si conjugat. Acesta poate fi utilizat pentru a etalona cititorul Elisa.

Controlul AcM

Rândul 2A-H reprezintă controlul anticorpului monoclonal si constă în antigen VFC, anticorp monoclonal si conjugat.

Acesta reprezintă un control negativ. Media citirilor densitătilor optice pentru acest rând de control reprezintă valoarea de inhibitie 0%.

Controlul pozitiv

Rândul 3A-H reprezintă controlul pozitiv. Acesta constă în antigen VFC, dilutii ale antiserului pozitiv VFC, AcM si conjugat. Acesta este inclus ca un indicator al faptului că testul functionează corespunzător si că de la test la test trebuie să fie obtinute niveluri similare de inhibitie.

Seruri de testat

În schema de testare prezentată mai sus pot fi testate 18 seruri la o rată a dilutiei de 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Aceasta va da unele indicatii asupra titrului de anticorpi în serul de testat.

Această gamă de dilutii poate fi extinsă ulterior pentru a se obtine titruri finale ale dilutiei serului. În mod alternativ, pentru studiile serologice la scară mare, serurile pot fi testate la o dilutie unică de 1/4 sau la două dilutii de 1/2 si 1/4 ca un test de control rapid.

Procedura

1. Se diluează antigenul VFC cu concentratie pretitrată în PBS, se agită pentru scurt timp folosindu-se baia de ultrasunete pentru a dispersa virusul agregat, iar “dacă baia de ultrasunete nu este disponibilă, se pipetează viguros” si se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii Elisa. Se lovesc usor marginile plăcii pentru a dispersa antigenul.

2. Se incubează la temperatura de 37şC timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spală plăcile de trei ori prin umplerea si golirea godeurilor cu PBS nesteril si se usucă cu hârtie absorbantă.

3. Se adaugă 50 μl de tampon de blocare pentru fiecare godeu. Se adaugă serurile de testat si serul pozitiv în godeurile corespunzătoare si se diluează pe suprafata plăcii utilizându-se o pipetă cu canale multiple. Nu se adaugă ser în cazul controlului cu blanc sau controlului AcM.

4. Imediat după adăugarea serurilor de testat se diluează AcM în tamponul de blocare “cu dilutie pretitrată” si se adaugă 50 ml în toate godeurile plăcii, cu exceptia controlului cu blanc.

5. Se incubează la temperatura de 37şC timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spală de trei ori cu PBS si se usucă.

6. Se diluează concentratul de globuline de iepure anti-soarece la 1/5000 în tampon de blocare si se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii.

7. Se incubează la temperatura de 37şC timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spală de trei ori cu PBS si se usucă.

8. Se dezgheată OPD si imediat înainte de utilizare se adaugă 12 μl din peroxid de hidrogen 30% la fiecare 25 ml de OPD. Se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii. Se asteaptă aproximativ 10 minute pentru a se modifica culoarea si se opreste reactia cu acid sulfuric 1M “50 μl/godeu”. Culoarea trebuie să se modifice în godeurile de control al AcM si în acelegodeuri care contin seruri fără nici un anticorp VFC.

9. Se examinează si se înregistrează plăcile fie vizual, fie utilizându-se un cititor spectrofotometric.

Analiza rezultatelor

Se calculează media citirilor densitătilor optice “DO” plecându-se de la controalele AcM. Aceasta reprezintă valoarea de inhibitie 0%. Citirile densitătii optice ale serurilor de testat sunt exprimate ca valori procentuale de inhibitie, utilizându-se următoarea formulă:

Valoarea procentuală = 100 - DO în prezenta serului de testat x 100 de inhibitie DO în absenta serului de testat

Valorile de inhibitie mai mari de 40% la o dilutie a serului de 1/4 sunt considerate pozitive. Citirea vizuală este posibilă dacă o inhibitie de 40% este cea mai mică valoare usor vizibilă cu ochiul liber.

Prepararea antigenului VFC pentru tehnica Elisa

1. Se spală de 3 ori 10 plăci de celule confluente BHK-21 cu mediul Eagle’s fără ser si se infectează cu serotipul 1 al virusului febrei catarale într-un mediu Eagle’s fără ser.

2. Se incubează la temperatura de 37şC si se examinează zilnic pentru efectul citopatic “ecp”.

3. Atunci când ecp este evident pe 80-90% din stratul de celule al fiecărei plăci, se recuperează virusul prin agitarea celulelor aderente de sticlă.

4. Se centrifughează la 2.000-3.000 rot./min. pentru a precipita celulele.

5. Se înlătură supernatantul si se resuspendă celulele în aproximativ 30 ml de PBS continând 1% “Sarkosyl” si 2 ml de fluorură de fenilmetilsulfonil “tampon de liză”.

Aceasta poate determina celulele să formeze un gel si se pot adăuga mai multe tampoane de liză pentru a reduce acest efect.

NOTĂ:

Fluorura de fenilmetilsulfonil este dăunătoare - a se manipula cu prudentă extremă!

6. Se fragmentează celulele timp de 60 de secunde, folosindu-se o sondă ultrasonică la o amplitudine de 30 de microni.

7. Se centrifughează la 10.000 rot./min. timp de 10 minute.

8. Se depozitează supernatantul la temperatura de +4şC si se resuspendă celulele precipitate rămase în 10-20 ml de tampon de liză.

9. Se agită cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete si se clarifică, depozitând supernatantul în fiecare etapă, în total de 3 ori.

10. Se reunesc supernatantii si se centrifughează la 24.000 rot./min. timp de 120 de minute la temperatura de 4şC pe un tampon de 5 ml de sucroză 40% “w/v în PBS”, folosindu-se tuburi de centrifugare Beckmann de 30 ml si un rotor SW 28.

11. Se înlătură supernatantul, se drenează tuburile în întregime si se resuspendă granula de reziduu celular în PBS prin supunerea la ultrasunete. Se depozitează antigenul în cotepărti la -70şC.

Titrarea antigenului VFC pentru tehnica Elisa

Antigenul febrei catarale este titrat prin tehnica Elisa indirectă. Dilutii în bază doi de antigen sunt titrate fată de o dilutie constantă “1/50” de anticorpi monoclonali 3-17-A3.

Protocolul este după cum urmează:

Procedura

1. Se diluează antigen VFC în PBS de-a lungul plăcii de microtitrare în serii de dilutii, în bază doi “50 μl/godeu”, utilizându-se o pipetă cu canale multiple.

2. Se incubează timp de o oră la temperatura de 37şC într-un agitator orbital.

3. Se spală plăcile de trei ori cu PBS.

4. Se adaugă 50 ml din anticorpul monoclonal 3-17-A3 “diluat 1/50” în fiecare godeu al plăcii de microtitrare.

5. Se incubează timp de o oră la temperatura de 37şC într-un agitator orbital.

6. Se spală plăcile de trei ori cu PBS.

7. Se adaugă în fiecare godeu al plăcii de microtitrare 50 μl de globulină de iepure antisoarece conjugată la peroxidază de hrean, diluată până la o concentratie optimă pretitrată.

8. Se incubează o oră la temperatura de 37şC într-un agitator orbital.

9. Se adaugă substrat si cromogen după cum s-a descris anterior. Se opreste reactia după 10 minute, prin adăugarea de acid sulfuric 1 M “50 ml/godeu”.

În testul concurent anticorpul monoclonal trebuie să fie în exces, de aceea se alege o dilutie de antigen care cade pe curba de titrare “nu pe zona platou”, care dă aproximativ 0,8 DO după 10 minute.

Protocolul pentru testul de imunodifuzie pe gel de agar pentru detectarea anticorpilor bolii hemoragice epizootice

Testul de imunodifuzie pe gel de agar este efectuat în concordantă cu următorul protocol:

Materiale si reactivi

1. Antigen

Antigenul care precipită este preparat în orice sistem de cultură celulară care sustine multiplicarea rapidă a serotipului “serotipurilor” virale corespunzătoare ale virusului bolii hemoragice epizootice. Sunt recomandate celulele BKH sau celulele Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul cresterii virusului, dar pentru a fi eficient necesită o concentrare de la 50 până la 100 de ori. Aceasta poate fi realizată prin orice procedură standard de concentrare a proteinelor; virusul antigenului poate fi inactivat prin adăugarea de betapropiolactonă 0,3% .v/v”.

2. Serul de control pozitiv cunoscut

Utilizându-se serul international de referintă si antigenul, este produs un ser standard national, standardizat pentru proportia optimă fată de serul international de referintă, liofilizat si utilizat ca ser de control cunoscut în fiecare test.

3. Serul de testat

Procedură

1. Agaroza 1% preparată în tampon de borat sau de barbitol de sodiu, pH de la 8,5 la 9,0, este turnată într-o placă Petri de o adâncime minimă de 3,0 mm.

2. Un sablon de testat din 7 godeuri lipsite de umiditate, fiecare cu un diametru de 5,0 mm, este tăiat în agar. Sablonul constă într-un godeu central si 6 godeuri aranjate în jurul lui într-un cerc cu o rază de 3 mm.

 

 

1

 

6

X

2

5

4

3

 

3. Godeul central este umplut cu antigenul standard.

Godeurile periferice 2, 4 si 6 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt umplute cu seruri de testat.

4. Sistemul este incubat o perioadă de până la 72 de ore la temperatura camerei, într-o cameră umedă închisă.

Interpretare

Un ser de testat este pozitiv dacă formează o linie de precipitare specifică cu antigenul si formează o linie completă de identitate cu serul de control. Un ser de testat este negativ dacă nu formează o linie specifică cu antigenul si nu deviază curba serului de control. Plăcile Petri trebuie să fie examinate pe fond întunecat si utilizându-se iluminare indirectă.