MONITORUL OFICIAL AL ROMANIEI

P A R T E A I

Anul XIV - Nr. 659 LEGI, DECRETE, HOTÃRÂRI SI ALTE ACTE Joi, 5 septembrie 2002

SUMAR

HOTÃRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI

856. - Hotãrâre privind evidenta gestiunii deseurilor si pentru aprobarea listei cuprinzând deseurile, inclusiv deseurile periculoase

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE

ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

147. - Ordin al ministrului agriculturii, alimentatiei si pãdurilor pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantinã sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tãri terte

346. - Ordin al ministrului agriculturii, alimentatiei si pãdurilor pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind conditiile generale de igienã în exploatatiile de animale producãtoare de lapte

HOTÃRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI

GUVERNUL ROMÂNIEI

HOTÃRÂRE

privind evidenta gestiunii deseurilor si pentru aprobarea listei cuprinzând deseurile, inclusiv deseurile periculoase

În temeiul prevederilor art. 107 din Constitutia României si ale art. 181 alin. (1) din Ordonanta de urgentã a Guvernului nr. 78/2000 privind regimul deseurilor, aprobatã cu modificãri si completãri prin Legea nr. 426/2001,

Guvernul României adoptã prezenta hotãrâre.

Art. 1. - (1) Agentii economici care genereazã deseuri au obligatia sã tinã o evidentã a gestiunii acestora, în conformitate cu modelul prevãzut în anexa nr. 1, pentru fiecare tip de deseu.

(2) Datele centralizate anual privind evidenta gestiunii deseurilor se transmit autoritãtilor publice teritoriale pentru protectia mediului, la cererea acestora.

Art. 2. - (1) Agentii economici autorizati sã desfãsoare activitãti de colectare, transport, depozitare temporarã, valorificare si eliminare a deseurilor sunt obligati sã tinã evidenta gestiunii deseurilor conform art. 1 alin. (1) numai pentru deseurile generate în cadrul activitãtilor proprii.

(2) Evidenta gestiunii deseurilor colectate, transportate, depozitate temporar, valorificate si eliminate se raporteazã de cãtre agentii economici autorizati, mentionati la alin. (1), la solicitarea autoritãtilor publice teritoriale pentru protectia mediului sau a altor autoritãti ale administratiei publice centrale si locale care au atributii si rãspunderi în domeniul regimului deseurilor, conform prevederilor legale.

Art. 3. - (1) Pentru evidenta la nivel national a gestiunii deseurilor autoritatea publicã centralã de protectie a mediului organizeazã, împreunã cu autoritãtile publice teritoriale de protectie a mediului si cu alte institutii aflate în coordonare, raportarea statisticã anualã în acest domeniu.

(2) Metodologia si sistemul de raportare care stau la baza cercetãrilor statistice vor fi actualizate periodic de autoritatea publicã centralã de protectie a mediului, în conformitate cu cerintele legale în vigoare.

(3) Datele centralizate anual, referitoare la gestionarea deseurilor, se pãstreazã de cãtre autoritãtile publice teritoriale de protectie a mediului într-un registru de evidentã o perioadã de minimum 3 ani.

Art. 4. - (1) Pentru evidenta gestiunii deseurilor se stabileste, în baza prevederilor anexelor nr. IA si IB la Ordonanta de urgentã a Guvernului nr. 78/2000 privind regimul deseurilor, aprobatã cu modificãri si completãri prin Legea nr. 426/2001, lista cuprinzând deseurile, prevãzutã în anexa nr. 2.

(2) Lista cuprinzând deseurile, prevãzutã în anexa nr. 2, include si deseurile periculoase, stabilite în baza prevederilor art. 181 alin. (1) si ale anexelor nr. IC, ID si IE la Ordonanta de urgentã a Guvernului nr. 78/2000, aprobatã cu modificãri si completãri prin Legea nr. 426/2001.

(3) Deseurile periculoase prevãzute în anexa nr. 2 sunt marcate cu un asterisc (*).

Art. 5. - (1) Tipurile de deseuri prevãzute în anexa nr. 2 sunt definite în mod individual printr-un cod complet format din 6 cifre.

(2) Titlurile si subtitlurile categoriilor de deseuri sunt definite printr-un cod format din douã, respectiv din 4 cifre.

Art. 6. - Pentru încadrarea în anexa nr. 2 a unui deseu în mod individual, agentii economici au obligatia codificãrii acestora cu 6 cifre, dupã urmãtoarea procedurã:

a) se identificã activitatea generatoare de deseuri din cap. 01-12 sau 17-20;

b) se identificã subcapitolul în care se încadreazã deseul;

c) se identificã, în cadrul subcapitolului, deseul în mod individual, conform codului corespunzãtor, format din 6 cifre, excluzându-se codurile terminate cu 99;

d) dacã deseul nu este identificat la cap. 01-12 sau 17-20, se examineazã pentru identificarea deseului cap. 13, 14 si 15;

e) dacã deseul nu este identificat nici în cap. 13, 14 si 15, se examineazã cap. 16;

f) dacã deseul nu este identificat nici în cap. 16, atunci se examineazã pentru identificare codurile cu terminatia 99 - alte desuri, corespunzãtoare activitãtii din care provine deseul.

Art. 7. - Deseurile rezultate din colectarea ambalajelor, inclusiv amestecurile de ambalaje din materiale diferite, se încadreazã la codul 15 01, si nu la codul 20 01.

Art. 8. - (1) Deseurile clasificate ca periculoase - deseurile marcate cu asterisc (*) - prezintã una sau mai multe dintre proprietãtile periculoase din anexa nr. IE la Ordonanta de urgentã a Guvernului nr. 78/2000, aprobatã cu modificãri si completãri prin Legea nr. 426/2001.

(2) Deseurile care au proprietãtile prevãzute la H3 - H8, H10 si H11 din anexa nr. IE la Ordonanta de urgentã a Guvernului nr. 78/2000, aprobatã cu modificãri si completãri prin Legea nr. 426/2001, sunt periculoase dacã au una sau mai multe dintre urmãtoarele caracteristici:

a) temperaturã de inflamabilitate ≤ 55º C;

b) una sau mai multe substante clasificate ca foarte toxice, în concentratie totalã ≥ 0,1%;

c) una sau mai multe substante clasificate ca toxice, în concentratie totalã ≥ 3%;

d) una sau mai multe substante clasificate ca dãunãtoare, în concentratie totalã ≥ 25%;

e) una sau mai multe substante corosive clasificate ca R35, în concentratie totalã ≥ 1%;

f) una sau mai multe substante corosive clasificate ca R34, în concentratie totalã ≥ 5%;

g) una sau mai multe substante iritante clasificate ca R41, în concentratie totalã ≥ 10%;

h) una sau mai multe substante iritante clasificate ca R36, R37 si R38, în concentratie totalã ≥ 20%;

i) o substantã cunoscutã ca fiind cancerigenã din categoria 1 sau 2, în concentratie ≥ 0,1%;

j) o substantã cunoscutã ca fiind cancerigenã din categoria 3, în concentratie ≥ 1%;

k) o substantã toxicã pentru reproducere din categoria 1 sau 2, clasificatã ca R60 si R61, în concentratie ≥ 0,5%;

l) o substantã toxicã pentru reproducere din categoria 3, clasificatã ca R62 si R63, în concentratie ≥ 5%;

m) o substantã mutagenã din categoria 1 sau 2, clasificatã ca R46, în concentratie ≥ 0,1%;

n) o substantã mutagenã din categoria 3, clasificatã ca R40, în concentratie ≥ 1%.

(3) Pentru proprietãtile periculoase prevãzute la alin. (2) se fac urmãtoarele precizãri:

a) se utilizeazã pentru proprietatea periculoasã H10 denumirea toxic pentru reproducere, definitã în Ordonanta de urgentã a Guvernului nr. 200/2000 privind clasificarea, etichetarea si ambalarea substantelor si preparatelor chimice periculoase, aprobatã si modificatã prin Legea nr. 451/2001, pentru a se evidentia mai clar aceastã proprietate periculoasã;

b) substantele sunt clasificate ca periculoase în conformitate cu prevederile Hotãrârii Guvernului nr. 490/2002 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Ordonantei de urgentã a Guvernului nr. 200/2000 privind clasificarea, etichetarea si ambalarea substantelor si preparatelor chimice periculoase;

c) metal greu înseamnã orice compus al arsenului, cadmiului, cromului (VI), cuprului, plumbului, mercurului, nichelului, seleniului, staniului, stibiului, taliului si telurului, precum si acestea în formã metalicã, în mãsura în care sunt clasificate ca substante periculoase.

Art. 9. - Constituie contraventii si se sanctioneazã cu amendã de la 30 milioane lei la 75 milioane lei urmãtoarele fapte:

a) absenta evidentei gestiunii deseurilor;

b) înscrierea de date incorecte în evidenta gestiunii deseurilor;

c) neutilizarea codurilor deseurilor prevãzute în anexa nr. 2 pentru evidenta gestiunii deseurilor;

d) netransmiterea evidentei gestiunii deseurilor autoritãtilor publice centrale si autoritãtilor publice teritoriale de protectie a mediului.

Art. 10. - Constatarea contraventiilor si aplicarea sanctiunilor prevãzute la art. 9 se fac de cãtre personalul împuternicit din cadrul autoritãtii publice centrale de protectie a mediului si din cadrul autoritãtilor publice teritoriale de protectie a mediului.

Art. 11. - Contraventiilor prevãzute la art. 9 le sunt aplicabile dispozitiile Ordonantei Guvernului nr. 2/2001 privind regimul juridic al contraventiilor, aprobatã cu modificãri si completãri prin Legea nr. 180/2002.

Art. 12. - Anexele nr. 1 si 2 fac parte integrantã din prezenta hotãrâre.

Art. 13. - Pe data intrãrii în vigoare a prezentei hotãrâri se abrogã Hotãrârea Guvernului nr. 155/1999 pentru introducerea evidentei gestiunii deseurilor si a Catalogului European al Deseurilor, publicatã în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 118 din 23 martie 1999.

PRIM-MINISTRU

ADRIAN NÃSTASE

Contrasemneazã:

p. Ministrul apelor si protectiei mediului,

Ioan Jelev,

secretar de stat

Ministrul industriei si resurselor,

Dan Ioan Popescu

p. Ministrul agriculturii, alimentatiei si pãdurilor,

Petre Daea,

secretar de stat

p. Ministrul sãnãtãtii si familiei,

Radu Deac,

secretar de stat

Ministrul administratiei publice,

Octav Cozmâncã

Bucuresti, 16 august 2002.

Nr. 856.

ANEXA Nr. 1*)

EVIDENTA GESTIUNII DESEURILOR

Pagina 1

Pagina a 2-a

ANEXA Nr. 2*)

LISTA

cuprinzând deseurile, inclusiv deseurile periculoase

Pagina a 3-a	Pagina a 4-a	Pagina a 5-a	Pagina a 6-a	Pagina a 7-a	Pagina a 8-a
Pagina a 9-a	Pagina a 10-a	Pagina a 11-a	Pagina a 12-a	Pagina a 13-a	Pagina a 14-a
Pagina a 15-a	Pagina a 16-a	Pagina a 17-a

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PÃDURILOR

ORDIN

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantinã sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tãri terte

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pãdurilor,

în temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitarã veterinarã nr. 60/1974, republicatã, cu modificãrile si completãrile ulterioare,

în baza Hotãrârii Guvernului nr. 12/2001 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Pãdurilor, cu modificãrile si completãrile ulterioare,

vãzând Referatul de aprobare nr. 154.721 din 3 aprilie 2002, întocmit de Agentia Nationalã Sanitarã Veterinarã,

emite urmãtorul ordin:

Art. 1. - Se aprobã Norma sanitarã veterinarã privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantinã sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tãri terte, prevãzute în anexa care face parte integrantã din prezentul ordin.

Art. 2. - Directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. - Agentia Nationalã Sanitarã Veterinarã va controla modul de aducere la îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. - Prevederile normei sanitare veterinare prevãzute la art. 1 vor fi respectate de România în cazul exporturilor de animale vii din speciile bovine si porcine în Uniunea Europeanã, pânã când va deveni stat membru al Uniunii Europene.

Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, si va intra în vigoare în termen de 15 zile de la data publicãrii lui.

p. Ministrul agriculturii, alimentatiei si pãdurilor,

Petre Daea,

secretar de stat

Bucuresti, 10 aprilie 2002.

Nr. 147.

ANEXÃ

NORMÃ SANITARÃ VETERINARÃ

privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantinã sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tãri terte

CAPITOLUL I

Dispozitii generale

Prezenta normã sanitarã veterinarã stabileste protocoalele de testare pentru tuberculozã, brucelozã, leucozã enzooticã bovinã, bluetongue (febra cataralã), boala epizooticã hemoragicã, leptospirozã, rinotraheita bovina infectioasã/vulvovaginita pustularã infectioasã, diareea viralã bovinã, febra aftoasã, boala lui Aujeszky, gastroenterita transmisibilã, influenta suinã, boala veziculoasã a porcului, pesta porcinã clasicã, precum si conditiile pentru autorizarea târgurilor de animale, fermelor de carantinã sau centrelor de colectare pentru comertul cu animale din speciile bovine sau porcine destinate exportului.

CAPITOLUL II

Bovine

A. Tuberculozã

1. Urmãtoarele teste vor fi recunoscute ca fiind teste oficiale de tuberculinare intradermicã:

a) testul unic intradermic presupune o singurã injectare a tuberculinei bovine;

b) testul comparativ intradermic solicitã o injectare de tuberculinã bovinã si o injectare de tuberculinã aviarã, administrate simultan.

2. Doza de tuberculinã injectatã va fi:

a) nu mai micã de 2.000 UTC de tuberculinã bovinã;

b) nu mai micã de 2.000 u.i. de tuberculinã aviarã W15.

Volumul fiecãrei doze injectate nu va depãsi 0,2 ml.

3. Testele de tuberculinare se vor efectua prin injectarea tuberculinei/tuberculinelor în pielea gâtului. Locurile de injectare vor fi situate la limita dintre treimea anterioarã si cea mijlocie a gâtului. Când se injecteazã aceluiasi animal atât tuberculinã bovinã, cât si tuberculinã aviarã locul pentru injectarea tuberculinei aviare va fi la aproximativ 10 cm de linia superioarã a gâtului si locul pentru injectarea tuberculinei bovine va fi cu aproximativ 12,5 cm mai jos, pe o linie paralelã cu linia umãrului sau pe pãrti diferite ale gâtului; la animalele tinere la care nu existã loc sufficient pe o singurã parte a gâtului pentru a separa aceste locuri fiecare injectie va fi fãcutã pe câte o parte lateralã a gâtului, în locuri identice situate în centrul treimii mijlocii a gâtului.

4. Tehnica tuberculinãrii si interpretarea reactiilor vor fi urmãtoarele:

4.1. Tehnica tuberculinãrii: locul injectãrii va fi tuns si dezinfectat. Se va prinde între degetul mare si arãtãtor un pliu al pielii din interiorul zonei tunse si dezinfectate, se va mãsura cu sublerul si se va nota valoarea obtinutã. Un ac scurt, steril, tãiat oblic si atasat la o seringã gradatã continând tuberculinã va fi introdus oblic în straturile mai profunde ale pielii. Apoi se va injecta doza de tuberculinã.

O injectare corectã va fi confirmatã prin palparea unei mici ridicãturi asemãnãtoare unui bob de mazãre la fiecare loc de injectare. Grosimea pliului pielii din fiecare zonã injectatã va fi mãsuratã din nou dupã 72 de ore de la injectare si va fi notatã.

4.2. Interpretarea reactiilor

4.2.1. Interpretarea reactiilor se va baza pe observatiile clinice si pe cresterea/cresterile înregistratã/înregistrate a/ale locurilor de injectare, la 72 de ore dupã injectarea tuberculinei.

a) Reactia este negativã dacã se observã doar o inflamare limitatã, cu o crestere nu mai mare de 2 mm a grosimii pliului de piele, fãrã semne clinice ca edem difuz sau extins, transpiratie, necroze, dureri sau inflamatii ale canalelor limfatice din regiunea respectivã sau ale limfonodulilor.

b) Reactia este neconcludentã dacã nu se observã semne clinice precum cele mentionate la lit. a) si dacã cresterea pliului de piele este mai mare de 2 mm, dar mai micã de 4 mm.

c) Reactia este pozitivã dacã se observã semne clinice precum cele mentionate la lit. a) si b) sau dacã cresterea pliului de piele de la locul injectãrii este de 4 mm sau mai mare.

4.2.2. Interpretarea testelor oficiale de tuberculinare intradermicã va fi urmãtoarea:

4.2.2.1. Testul unic intradermic:

a) pozitiv: o reactie pozitivã ca cea definitã la lit. c);

b) neconcludent: o reactie neconcludentã ca cea definitã la lit. b);

c) negativ: o reactie negativã ca cea definitã la lit. a).

4.2.2.1.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul unic intradermic vor fi supuse unui alt test dupã minimum 42 de zile.

4.2.2.1.2. Animalele care nu au reactionat negativ la acest al doilea test vor fi considerate ca fiind pozitive la test.

4.2.2.1.3. Animalele care au reactionat pozitiv la testul unic intradermic pot fi supuse unui test comparativ intradermic.

4.2.2.2. Testul comparativ intradermic pentru stabilirea si mentinerea statusului de efectiv oficial indemn de tuberculozã:

a) pozitiv: o reactie pozitivã la tuberculina bovinã cu 4 mm mai mare decât reactia la tuberculina aviarã sau prezenta semnelor clinice;

b) neconcludent: o reactie pozitivã sau neconcludentã la tuberculina bovinã, care este cu 1-4 mm mai mare decât reactia la tuberculina aviarã, si absenta semnelor clinice;

c) negativ: o reactie negativã la tuberculina bovinã sau o reactie pozitivã ori neconcludentã la tuberculina bovinã, dar care este egalã sau mai micã decât o reactie pozitivã ori neconcludentã la tuberculina aviarã, precum si absenta semnelor clinice în ambele cazuri.

4.2.2.2.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul comparativ intradermic vor fi supuse unui alt test dupã minimum 42 de zile. Animalele care nu au reactionat negativ la acest al doilea test vor fi considerate ca fiind pozitive.

4.2.3. Statutul de efectiv oficial indemn de tuberculozã poate fi suspendat si animalelor din efectiv nu li se va permite sã ia parte la comertul intracomunitar pânã la rezolvarea statusului urmãtoarelor animale:

a) animalele care au fost considerate neconcludente la testul unic intradermic de tuberculinare;

b) animalele care au fost considerate pozitive la testul unic intradermic în perioada de asteptare a retestãrii cu un test comparativ intradermic;

c) animalele care au fost considerate neconcludente la testul comparativ intradermic.

4.2.4. Atunci când legislatia sanitarã veterinarã solicitã ca animalele sã fie supuse unui test intradermic anterior miscãrii lor, testul va fi interpretat astfel încât nici un animal care prezintã o crestere a grosimii pliului de piele mai mare de 2 mm sau prezintã semne clinice sã nu fie comercializat.

B. Brucelozã

1. Testele de seroaglutinare

1.1. Serul aglutinant standard trebuie sã fie conform serului etalon preparat de Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Regatul Unic al Marii Britanii si Irlandei de Nord. Fiola trebuie sã continã 1.000 u.i. aglutinante, obtinute prin liofilizarea a 1 ml ser bovin.

1.2. Aprovizionarea cu serul standard trebuie sã fie asiguratã prin Bundesgesudheitsand, Berlin.

1.3. Titrul aglutinant al serului trebuie sã fie exprimat în unitãti internationale/ml, de exemplu, serum X = 80 u.i./ml.

1.4. Citirile reactiei lente de seroaglutinare în tuburi trebuie fãcute la nivelul unei aglutinãri de 50% sau 75%, iar antigenul utilizat trebuie sã fie titrat în conditii identice fatã de un ser standard.

1.5. Valorile aglutinante ale diferitilor antigeni fatã de serul standard trebuie sã se încadreze în urmãtoarele limite:

a) dacã citirea se face la 50% - între 1/600 si 1/1.000;

b) dacã citirea se face la 75% - între 1/500 si 1/750.

1.6. Pentru prepararea antigenului destinat seroaglutinãrii lente în tuburi trebuie folosite tulpinile Weybridge nr. 99 si USDA 1119 sau orice alte tulpini de sensibilitate echivalentã.

1.7. Mediile de culturã folosite pentru întretinerea tulpinilor de laborator, precum si pentru producerea antigenului trebuie sã nu producã disociere bacterianã S-R, fiind preferabilã folosirea agarului cu cartof.

1.8. Emulsia bacterianã trebuie fãcutã în solutie salinã fiziologicã NaCl 0,85ä, fenolat 5%. Formolul nu trebuie folosit.

1.9. Institutul oficial responsabil de testarea oficialã a antigenilor este Institutul de Diagnostic si Sãnãtate Animalã, str. dr. Staicovici nr. 63, Bucuresti.

1.10. Antigenii pot fi livrati în formã concentratã cu conditia ca factorul de dilutie care trebuie utilizat sã fie indicat pe eticheta flaconului.

1.11. Pentru efectuarea unei reactii de seroaglutinare trebuie preparate cel putin 3 dilutii pentru fiecare ser.

Dilutiile serului suspect trebuie efectuate de asa manierã încât citirea reactiilor la limita de infectie sã fie fãcutã în tubul din mijloc. Dacã existã o reactie pozitivã în acest tub, serul suspect contine minimum 30 u.i. aglutinante/ml.

2. Reactia de fixare a complementului

2.1. Serul standard este acelasi cu cel mentionat la pct. 1.1. Pe lângã continutul sãu în unitãti internationale aglutinante, 1 ml din acest ser bovin liofilizat trebuie sã continã 1.000 de unitãti sensibilizante care fixeazã complementul. Aceste unitãti sensibilizante sunt denumite unitãti sensibilizante CEE.

2.2. Serul standard trebuie sã fie asigurat prin Bundesgesundheitsand, Berlin.

2.3. Titrul de anticorpi al serului care fixeazã complementul trebuie sã fie exprimat în unitãti sensibilizante CEE (de exemplu: serul X = 60 de unitãti sensibilizante CEE/ml).

2.4. Un ser continând 20 sau mai multe unitãti sensibilizante CEE/ml (si anume o activitate egalã cu 20% din cea a serului standard) trebuie sã fie considerat pozitiv.

2.5. Serurile trebuie inactivate dupã cum urmeazã:

a) serul bovin: la temperatura de 56-60ºC timp de 30-50 minute;

b) serul porcin: la temperatura de 60ºC timp de 30-50 minute.

2.6. Tulpina Weybridge nr. 99 sau tulpina USDA 1119 trebuie sã fie folosite la prepararea antigenului. Antigenul reprezintã o suspensie bacterianã în ser fiziologic 0,85% NaCl sau în solutie tampon Veronal.

2.7. Pentru efectuarea reactiei de fixare a complementului s-a convenit utilizarea unei doze de complement superioare dozei minime necesare unei hemolize totale.

2.8. La efectuarea reactiei de fixare a complementului este necesar sã se efectueze de fiecare datã urmãtoarele controale:

a) controlul efectului anticomplementar al serului;

b) controlul antigenului;

c) controlul eritrocitelor sensibilizate;

d) controlul complementului;

e) controlul sensibilitãtii la declansarea reactiei, utilizându-se un ser pozitiv;

f) controlul specificitãtii reactiei, utilizându-se un ser negativ.

2.9. Supravegherea si controlul oficial al serurilor standard si al antigenilor trebuie efectuate de organismul mentionat la pct. 1.9.

2.10. Antigenii pot fi livrati în stare concentratã, dar cu mentionarea factorului de dilutie pe eticheta flaconului.

C. Leucoza enzooticã bovinã

1. Testul de imunodifuzie în gel de agar pentru leucozã enzooticã bovinã (LEB)

1.1. Antigenul care va fi folosit în test trebuie sã continã glicoproteine ale virusului LEB. Antigenul trebuie sã fie standardizat împotriva unui ser standard (serul El) furni- zat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga.

1.2. Institutul oficial care trebuie sã fie rãspunzãtor de calibrarea antigenului standard de lucru din laborator împotriva serului standard oficial CEE (serul El) furnizat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga, este Institutul de Diagnostic si Sãnãtate Animalã, str. dr. Staicovici nr. 63, Bucuresti.

1.3. Antigenii standard folositi în laborator trebuie supusi cel putin o datã pe an, în laboratoarele CEE mentionate la pct. 1.2, testãrii contra serului standard oficial al CE.

Separat de aceastã standardizare antigenul din uz poate fi calibrat conform metodei de standardizare descrise mai jos.

1.4. Reagentii folositi sunt:

a) antigenul: trebuie sã continã glicoproteine specifice ale virusului LEB, care au fost standardizate contra serului oficial al CEE;

b) serul de testat;

c) serul de control care este cunoscut ca pozitiv;

d) gel de agar: 0,8% agar, 8,5% NaCl, tampon Tris 0,05 M cu pH 7,2. O cantitate de 15 ml din acest gel trebuie introdusã într-o placã Petri cu diametrul de 85 mm, rezultând o grosime de 2,6 mm a agarului.

1.5. Modelul dupã care se realizeazã testul constã în tãierea în agar a 7 godeuri uscate, pânã la fundul plãcii;

modelul va consta într-un godeu central si 6 godeuri plasate circular în jurul acestuia dupã cum urmeazã:

a) diametrul godeului central = 4 mm;

b) diametrul godeurilor periferice = 6 mm;

c) distanta dintre godeul central si godeurile periferice = 3 mm.

1.6. Godeul central trebuie umplut cu antigen standard.

Godeurile periferice 1 si 4 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 2, 3, 5 si 6, cu serurile de testat.

Godeurile trebuie umplute pânã la disparitia meniscului.

1.7. Aceste rezultate au fost obtinute folosindu-se urmãtoarele cantitãti:

a) antigen - 32 µl;

b) ser pozitiv - 73 µl ser de control;

c) ser de testat - 73 µl ser care este suspect.

1.8. Incubatia trebuie sã dureze 72 de ore la o temperaturã a camerei de 20-27ºC, într-o încãpere închisã si umedã.

1.9. Testul poate fi citit la 24 si 48 de ore, dar rezultatul final nu poate fi obtinut înainte de 72 de ore.

a) Serul testat este pozitiv dacã formeazã o linie specificã de precipitare cu antigenul virusului LEB si o linie completã de identificare cu serul de control.

b) Serul testat este negativ dacã nu formeazã o linie specificã de precipitare cu antigenul virusului LEB si dacã nu curbeazã linia produsã de serul de control.

c) Reactia nu poate fi consideratã concludentã dacã:

(i) curbeazã linia serului de control spre godeul cu antigenul virusului LEB, fãrã a forma o linie de precipitare vizibilã cu antigenul; sau

(ii) nu poate fi cititã ca negativã sau pozitivã.

În reactiile neconcludente testul poate fi repetat folosindu-se un ser concentrat.

1.10. Orice altã configuratie sau model poate fi folosit cu conditia ca serul E4 diluat 1/10 în serul negativ sã poatã fi detectat ca fiind pozitiv.

1.1.1. Metoda pentru standardizarea antigenului (Solutii si materiale necesare)

1. 40 ml de agar 1,6% în tampon Tris/HCl 0,05% M cu pH 7,2 cu 8,5% NaCl;

2. 15 ml ser contra LEB, continând anticorpi doar pentru glicoproteinele virusului LEB, diluat 1/10 în tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;

3. 15 ml ser contra LEB având anticorpi doar pentru glicoproteinele virusului LEB, diluat 1/5 în tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;

4. 4 plãci Petri din plastic cu diametrul de 85 mm;

5. un perforator cu un diametru de la 4 mm pânã la 6 mm;

6. antigen de referintã;

7. antigenul care urmeazã sã fie standardizat;

8. o baie de apã la temperatura de 56ºC.

1.1.2. Mod de lucru

a) Se dizolvã agarul (1,6%) în tampon Tris/HCl, încãlzindu-l cu atentie pânã la temperatura de 100ºC. Se tine pe baia de apã timp de aproximativ o orã. De asemenea, se pun dilutiile de ser contra LEB pe o baie de apã.

b) Se amestecã 15 ml din solutia de agar la temperatura de 56ºC cu 15 ml ser contra LEB (1/10), scuturând rapid si turnând 15 ml în fiecare dintre cele douã plãci Petri. Se repetã aceastã procedurã cu serul contra LEB diluat 1/5.

c) Când agarul s-a întãrit se vor practica godeurile si se va face adãugarea antigenilor dupã cum urmeazã:

1. plãcile Petri 1 si 3:

a) godeul A - antigen de referintã nediluat;

b) godeul B - antigen de referintã diluat 1/2;

c) godeurile C si E - antigen de referintã;

d) godeul D - antigen de testat nediluat;

2. plãcile Petri 2 si 4:

a) godeul A - antigenul de testat nediluat;

b) godeul B - antigenul de testat diluat 1/2;

c) godeul C - antigenul de testat diluat 1/4;

d) godeul D - antigenul de testat diluat 1/8.

1.1.3. Instructiuni suplimentare

a) Experimentul trebuie sã fie efectuat cu douã dilutii de ser 1/5 si 1/10 în scopul obtinerii precipitãrii optime.

b) Dacã diametrul precipitãrii este prea mic pentru fiecare dintre cele douã dilutii, este necesarã diluarea în continuare a serului.

c) Dacã diametrul precipitãrii este prea mare si neclar pentru fiecare dintre cele douã grade de dilutie, atunci va trebui aleasã o dilutie mai micã a serului.

d) Concentratia finalã a agarului trebuie sã fie de 0,8%, iar cea a serurilor de 5% si, respectiv, 10%.

e) Se noteazã diametrele mãsurate în urmãtorul system de coordonate. Dilutia de lucru este cea la care s-a înregistrat acelasi diametru pentru antigenul de testat si antigenul de referintã.

D. Bluetongue (febra cataralã)

1. Testul ELISA de blocare sau competitiv se va efectua conform urmãtorului protocol:

a) Testul ELISA competitiv care utilizeazã anticorpul monoclonal 3-17-A3 este capabil sã detecteze anticorpii tuturor serotipurilor cunoscute ale virusului bluetongue (BTV).

b) Principiul testului constã în întreruperea reactiei dintre antigenul BTV si un anticorp monoclonal specific de grup (3-17-A3) prin adãugarea dilutiilor de ser de testare.

Anticorpii de BTV prezenti în serul de testare blocheazã reactivitatea anticorpului monoclonal (ACM) si determinã reducerea dezvoltãrii culorii scontate la adãugarea substratului enzimatic.

1.1. Materiale si reactivi:

1. plãci de microtitru cu suprafatã platã;

2. antigen pregãtit conform procedurii descrise mai sus;

3. tampon de blocare: 5% (w/v) lapte praf deshidratat Marvel, 0,1% (v/v) de tween-20 furnizat sub formã de sirop de polioxietilenã sorbiton monolaurat în PBS;

4. anticorp monoclonal: 3-17-A3 (furnizat sub formã de supernatant de culturã tisularã hybridomã), depozitat la temperatura de -20ºC sau liofilizat, diluat 1/50 cu tampon de blocare înainte de folosire, dirijat contra polipeptidei p7 specificã grupului;

5. conjugat: globulinã de iepure antisoarece (adsorbit si diluat), conjugatã cu peroxidazã din hrean si pãstratã la loc întunecos la temperatura de 4ºC;

6. substrat si cromogen: 0,2 g de ortofenil diaminã (OPD) dizolvat într-un tampon de 2,553 g acid citric si 4,574 g disodiu hidrogenortofosfat dizolvat în 500 ml de apã distilatã, divizatã în alicote de 25 ml si pãstrate la loc întunecos la temperatura de -20ºC, cu 12 µl/25 ml de peroxid de hidrogen (30% w/v) adãugat imediat înainte de utilizare;

ATENTIE! A se utiliza OPD cu atentie, a se purta mãnusi din cauciuc, produs suspect de a fi mutagen.

7. acid sulfuric de 1 mol: 26,6 ml de acid sulfuric adãugat la 473,4 ml de apã distilatã;

ATENTIE! Întotdeauna adãugati acidul peste apã, niciodatã apa peste acid.

8. agitator orbital;

9. cititor de placã ELISA (testul poate fi citit vizual).

Antigen orb + Control conjugat

Antigen + Mab

Control conjugat

Antigen + ser pozitiv + acm + conjugat

Seruri de testat

Antigen + conjugat
Antigen + acm + Conjugat
Antigen + Ser pozitiv + acm + Conjugat
1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256
Ser de testat
1/2	1/4	1/8	1/16	1/2	1/4	1/8	1/16

1.2. Protocolul testului:

Control orb: linia 1A-H este un control orb care contine antigen BTV si conjugat. Acesta poate fi folosit la etalonarea cititorului ELISA.

1.3. Control ACM: linia 2A-H este controlul anticorpului monoclonal si cuprinde antigen BTV, anticorp monoclonal si conjugat. Acesta reprezintã un control negativ. Media valorilor densitãtii optice ale acestei linii de control reprezintã valoarea de inhibitie 0%.

1.4. Control pozitiv: linia 3A-H este controlul pozitiv.

Acesta cuprinde antigen BTV, dilutii de antiser pozitiv BTV, ACM si conjugat si este inclus pentru a indica faptul cã testul este efectuat corespunzãtor si cã trebuie sã se obtinã niveluri similare de inhibitie de la un test la altul.

1.5. Serurile de testare: în schema testului prezentatã mai sus 18 seruri pot fi testate în dilutii de 1/2, 1/4, 1/8 si 1/16. Acest lucru oferã informatii asupra titrului de anticorpi din serurile de testare. Gama de dilutii poate fi lãrgitã pentru a obtine titruri finale de dilutii ale serului. Alternativ, H G F E D C B A pentru supraveghere serologicã la scarã largã, serurile pot fi testate într-o singurã dilutie (1/4) sau în douã dilutii ½ si 1/4 ca test de control rapid.

1.6. Procedura:

1. Se dilueazã antigen BTV la concentratie pretitratã în PBS, se agitã usor pentru a dispersa virusul agregat (dacã agitatorul nu este disponibil, se pipeteazã puternic) si se adaugã 50 µl în toate godeurile plãcii ELISA. Se agitã usor marginile plãcii pentru a se dispersa antigenul.

2. Se incubeazã la temperatura de 37ºC timp de 60 de minute cu ajutorul unui agitator orbital. Se spalã plãcile de 3 ori prin golirea si umplerea godeurilor cu PBS nesteril si se usucã cu ajutorul unei hârtii absorbante.

3. Se adaugã 50 µl la fiecare godeu de tampon de blocare. Se adaugã serurile de testare si ser pozitiv în godeurile corespunzãtoare si se dilueazã pe suprafata plãcii cu ajutorul unei pipete cu multiple canale. Nu se adaugã ser la controlul orb sau controlul acm.

4. Imediat dupã adãugarea serurilor de testare se adaugã acm în tamponul de blocare la dilutie pretitratã si se adaugã 50 µl în toate godeurile plãcii, cu exceptia controlului orb.

5. Se incubeazã la temperatura de 37ºC timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spalã de 3 ori si cu PBS si se usucã cu ajutorul unei hârtii absorbante.

6. Se dilueazã concentratul de iepure antisoarece la 1/5.000 într-un tampon de blocare si se adaugã 50 µl în toate godeurile plãcii.

7. Se incubeazã la temperatura de 37ºC timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spalã de 3 ori si cu PBS si se usucã cu ajutorul unei hârtii absorbante.

8. Se dizolvã OPD si imediat înainte de utilizare se adaugã 12 µl de 30% apã oxigenatã la fiecare 25 ml de OPD. Se adaugã 50 µl în toate godeurile plãcii. Se lasã circa 10 minute sã se dezvolte culoarea si se împiedicã reactia de 1 ml acid sulfuric 50 µl la godeu. Culoarea trebuie sã se dezvolte în godeurile de control ACM si în acele godeuri care contin sãruri fãrã anticorpi la BTV.

9. Se examineazã si se înregistreazã plãcile fie vizual, fie cu ajutorul unui cititor spectrofotometric.

1.7. Interpretarea rezultatelor:

a) Se calculeazã valoarea medie a OD dupã citirea controalelor acm. Aceasta reprezintã valoarea de inhibitie 0%. Citirile densitãtii optice a serurilor de testare sunt exprimate ca valori inhibitoare procentuale, folosindu-se urmãtoarea formulã:

OD în prezenta serului de testare

Valoarea de inhibitie procentualã = 100 x OD în absenta serului de testare

b) Valorile de inhibitie mai mari de 40% la o dilutie de ser de 1/4 sunt considerate pozitive. Citirea vizualã este posibilã având în vedere cã inhibitia de 40% este cea mai micã valoare vizibilã.

1.8. Prepararea antigenului BTV ELISA:

1. Se spalã de trei ori 10 roux de celule confluente bhk-21 cu un mediu Eagle fãrã ser si se infecteazã cu serotipul 1 de virus BTV într-un mediu Eagle fãrã ser.

2. Se incubeazã la temperatura de 37ºC si se examineazã zilnic pentru efectul citopatic (CPE).

3. Când efectul citopatic este evident în 80-90% din placa de celule din fiecare roux se recolteazã virusul prin agitare pentru a detasa celulele rãmase pe sticlã.

4. Se centrifugheazã la 2.000-3.000 rpm pentru a granula celulele.

5. Se îndepãrteazã supernatantul si se resuspendã celulele în circa 30 ml de PBS continând 1% sarkosyl si 2 ml de fluoridã fenolmetilsulfonil (tampon de distrugere a celu- lelor). Acest lucru poate cauza o gelificare a celulelor si se pot adãuga mai multe tampoane de distrugere a celulelor pentru a reduce acest efect.

ATENTIE! Fluorura fenolmetilsulfonil este toxicã, a se utiliza cu extremã atentie!

6. Se disociazã celulele timp de 60 de secunde cu ajutorul unei sonde ultrasonice la o amplitudine de 30 de microni.

7. Se centrifugheazã la 10.000 rpm timp de 10 minute.

8. Se stocheazã supernatantul la temperatura de +4ºC si se resuspendã celulele granulate rãmase în 10-20 ml de tampon de distrugere a celulelor.

9. Se agitã cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete si se clarificã, se stocheazã supernatantul în fiecare stadiu, în total de 3 ori.

10. Se adunã supernatantii si se centrifugheazã la 24.000 rpm timp de 120 de minute, la temperatura de +4ºC peste un strat de 5 ml de 40% sucrozã w/v în PBS, folosindu-se 30 ml tuburi de centrifugare Beckmann si un rotor SW 28.

11. Se înlãturã supernatantul, se dreneazã tuburile si se resuspendã celulele granulate în PBS prin ultrasonare. Se stocheazã antigenul în alicote la temperatura de -70ºC.

1.9. Titrarea antigenului BTV ELISA:

Antigenul BTV ELISA este titrat prin ELISA indirect.

Douã dilutii de antigen sunt titrate cu ajutorul unei dilutii constante (1/50) de anticorpi monoclonali 3-17-A3.

Protocolul este urmãtorul:

1.10. Procedura:

1. Se dilueazã antigen de BTV în PBS peste placa de microtitru într-o serie de douã dilutii 50 µl/godeu cu ajutorul unei pipete cu multiple canale.

2. Se incubeazã timp de o orã la temperatura de 37ºC într-un agitator orbital.

3. Se spalã plãcile de 3 ori cu PBS.

4. Se adaugã 50 µl de anticorp monoclonal 3-17-A3 diluat 1/50 în fiecare godeu al plãcii de microtitru.

5. Se incubeazã timp de o orã la temperatura de 37ºC într-un agitator orbital.

6. Se spalã plãcile de 3 ori cu PBS.

7. Se adaugã 50 µl de globulinã de iepure antisoarece conjugatã cu peroxidazã din hrean, diluatã la o concentratie optimã pretitratã, în fiecare godeu al plãcii de microtitru.

8. Se incubeazã timp de o orã la temperatura de 37ºC într-un agitator orbital.

9. Se adaugã substrat si cromogen ca mai sus. Se împiedicã reactia dupã 10 minute prin adãugarea unui mol de acid sulfuric 50 µl/godeu.

1.11. În încercarea concurentã anticorpul monoclonal trebuie sã fie în exces, de aceea se alege o solutie de antigen care se gãseste pe curba de titrare ‘nu în zona plãcii”, care dã circa 0,8 OD dupã 10 minute.

2. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform urmãtorului protocol:

2.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat în orice sistem de culturã celularã care suportã rapida multiplicare a serotipului specific de virus BTV. Sunt recomandate celulele BHK si Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul cresterii virusului, dar trebuie concentrat de 50-100 de ori pentru a fi eficace. Acest lucru se poate realiza prin orice procedurã standard de concentrare proteicã; virusul din antigen poate fi inactivat prin adãugarea a 0,3% v/v betapropiolactonã.

2.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizându-se un ser de referintã international si un antigen, este produs un ser national standard, standardizat la proportii optime în raport cu serul international de referintã, liofilizat si folosit ca ser de control cunoscut în fiecare test.

2.3. Ser de testare

2.4. Procedura:

a) 1% agarozã preparatã în tampon de borat sau barbitol de sodiu, pH 8,5-9,0, este turnatã într-o placã Petri la o adâncime minimã de 3,0 mm.

b) Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezealã, fiecare cu diametrul de 5,0 mm, este tãiat în agar. Ansamblul constã într-un godeu central si 6 godeuri dispuse într-un cerc cu raza de 3 mm.

	1
6		2
	X
5		3
	4

c) Se umple godeul central cu antigen standard.

Godeurile periferice 2, 4 si 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt umplute cu ser de testat.

d) Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambiantã într-o camerã închisã, umedã.

2.5. Interpretare: un ser de testare este pozitiv dacã formeazã o linie de precipitinã specificã cu antigenul, precum si o linie completã de identificare cu serul de control. Un ser de testare este negativ dacã nu formeazã o linie specificã cu antigenul si nu curbeazã linia serului de control.

Plãcile Petri trebuie examinate pe un fond întunecat si folosind o luminã indirectã.

E. Boala epizooticã hemoragicã

1. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform urmãtorului protocol:

1.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat în orice sistem de culturã celularã compatibil cu rapida multiplicare a serotipului specific virusului bolii epizootice hemoragice.

Sunt recomandate celulele BHK si Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul cresterii virusului, dar trebuie concentrat de 50-100 de ori pentru a fi eficient. Acest lucru se poate realiza prin orice procedurã standard de concentrare proteicã; virusul din antigen poate fi inactivat prin adãugarea a 0,3% v/v betapropiolactonã.

1.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizându-se serul international de referintã si un antigen, este produs un ser national standard, standardizat pentru a obtine o proportie optimã în raport cu serul de referintã international, liofilizat si folosit ca ser de control cunoscut în fiecare test.

Serul de testat

1.3. Procedura: 1% agarozã preparatã în tampon de borat sau barbitol de sodiu, pH 8,5-9,0, este turnatã într-o placã Petri la o adâncime minimã de 3,0 mm.

1.4. Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezealã, fiecare cu diametrul de 5,0 mm, este tãiat în agar. Ansamblul constã într-un godeu central si 6 godeuri dispuse într-un cerc cu raza de 3 mm, de exemplu:

	1
6		2
	X
5		3
	4

1.5. Godeul central este umplut cu antigen standard.

Godeurile periferice 2, 4 si 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt umplute cu ser de testare.

1.6. Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambiantã într-o încãpere închisã, umedã.

1.7. Interpretare: un ser de testare este pozitiv dacã formeazã o linie de precipitinã specificã cu antigenul, precum si o linie completã de identificare cu serul de control. Un ser de testare este negativ dacã nu formeazã o linie specificã cu antigenul si nu curbeazã linia serului de control.

Plãcile Petri trebuie examinate pe un fond întunecat si folosind o luminã indirectã.

F. Leptospirozã

1. Testul de aglutinare microscopicã va fi efectuat conform urmãtorului protocol:

1.1. Culturi: trebuie pãstrate în mediile Korthof’s sau EMJH la temperatura de 30ºC.

1.2. Antigen: contine 2 x 108 organisme/ml din mediul de culturã.

1.3. Procedurã: cantitãti egale de antigen si ser sunt amestecate în plãci de microtitru cu fund plat si sunt incubate la temperatura de 30ºC timp de douã ore sau la temperatura de 37ºC timp de 1-1 1/2 h. Testul este citit într-o luminã slabã, pe fond întunecat, folosind o magnitudine între 60x si 100x.

1.4. Interpretare: rezultatul este negativ dacã aglutinarea este mai micã de 50% la o dilutie de 1/50.

G. Rinotraheita bovinã infectioasã/vulvovaginita pustularã infectioasã

1. Testul de neutralizare a serului se va efectua conform urmãtorului protocol:

1.1. Ser: toate serurile sunt inactivate la temperatura de 56ºC timp de 30 de minute înainte de folosire.

1.2. Procedurã: pentru testul de seroneutralizare constantã a diferitelor tipuri de virusuri, realizat pe plãci de microtitru, se folosesc celulele MDBK sau alte celule corespunzãtoare. Tulpinile Colorado, Oxford sau orice altã tulpinã de virus de referintã sunt folosite la 100 TCID50 la 0,025 ml; probe de ser nediluat inactivat sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie de virus.

Amestecurile de ser/virus sunt incubate timp de 2 ore la temperatura de 37ºC în plãcile de microtitru, înainte ca celulele MDBK sã fie adãugate. Celulele sunt folosite la o concentratie care formeazã o monoculturã completã dupã 24 de ore.

1.3. Controale:

a) infectiozitatea virusului;

b) toxicitatea serului;

c) culturi celulare care nu au fost inoculate;

d) antiseruri de referintã.

1.4. Interpretare: rezultatele testului de neutralizare si titrul virusului folosit la testare sunt înregistrate dupã 3-6 zile de incubare la temperatura de 37ºC. Titrurile serului sunt considerate negative dacã nu existã nici o neutralizare la o dilutie de 1/2 (ser nediluat).

H. Diaree viralã bovinã (BVD)

1. Testul de izolare a virusului va fi efectuat conform urmãtorului protocol:

a) Materialul de testare si metodele de detectare: se folosesc suspensii de ser, portiuni retractile de coagul sau coaguli de sânge colectate de la probe de sânge proaspãt, care nu au fost inactivate la cald, prelevate de la animale domestice de mai mult de 6 luni. Se foloseste o procedurã de colorare imunologicã, precum tehnica anticorpului fluorescent (FA) sau ELISA, de exemplu imunoperoxidazã

(IPX), pentru a detecta virusul BVD în culturile inoculate.

b) Reactivii de testare: pentru testul FA se cere antiser specific de BVD conjugat cu FITC. Pentru testul IPX se cere ser anti-BVD specific, neconjugat, de origine bovinã, antiser antibovin conjugat cu peroxidazã si substrat enzimatic corespunzãtor (de exemplu: 3-amino-9-etilcarbazol).

Se poate folosi ser anti-BVD recoltat de la alte specii decât bovine, cu conditia ca conjugatul de peroxidazã sã fie dirijat împotriva globulinelor serice ale speciei respective. Toate serurile antivirale folosite trebuie sã aibã o specificitate doveditã si sã prezinte o reactivitate mare.

c) Procedura: testul foloseste celule susceptibile ca celule turbinate bovine, rinichi de vitel sau testicul de vitel fãrã virus BVD endogen. Probe de ser: serul de testare si celulele de culturã tisularã sunt plasate în culturi în tuburi acoperite cu dop, în godeuri de plãci de microtitru sau alte containere, astfel încât dilutia finalã sã fie 10%.

d) Învelisul inflamator si cheagurile de sânge: probele sunt adãugate la culturi celulare monostratificate, confluente si lãsate timp de o orã la temperatura de 37ºC, apoi culturile sunt spãlate si acoperite de mediu de culturã ce contine 10% ser de fetus de vitel, indemn de BVD.

Culturile sunt incubate ulterior la temperatura de 37ºC, fixate si colorate prin metodele FA sau IPX.

e) Controale:

e) 1. control pozitiv al virusului BVD;

e) 2. control negativ fãrã adaos de virus.

f) Interpretare: testul FA este colorat dupã 4-6 zile de incubare si citit cu ajutorul razelor ultraviolete. Fluorescenta celulelor incubate cu probele de testat este interpretatã ca rezultat pozitiv. Testul IPX este colorat dupã 4 zile de incubare si citit la luminã microscopicã. Culoarea maro închis apãrutã în citoplasma anumitor celule este interpretatã ca rezultat pozitiv.

2. Testul de seroneutralizare serologicã va fi efectuat conform urmãtorului protocol:

a) Ser: toate serurile sunt inactivate la cald, la temperatura de 56ºC, timp de 30 de minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de neutralizare constantã a diferitelor tipuri de virus pe plãci de microtitru foloseste cellule bovine corespunzãtoare, multiplicate în serii (celule bovine turbinate, descrise de Mcclurkin si altii, 1974, Arch. ges. Virusforch., p. 45, 285-289).

c) Este esential ca toti reactivii si celulele sã fie indemne de virusul BVD/MD necitopatic, accidental contaminante.

d) Virusul de testare, care poate fi orice tulpinã corespunzãtoare de referintã citopaticã (de exemplu: tulpina NADL), este folosit la o concentratie de 100 doze infectioase de culturã celularã medie la 0,025 ml. Dilutii de seruri inactivate sunt amestecate cu volume egale de suspensie viralã (0,025 ml) si amestecurile de ser-virus sunt incubate timp de o orã la temperatura de 37º înainte de a fi adãugate volume similare de suspensie celularã. Celulele sunt folosite la o concentratie care va forma un monostrat complet dupã douã zile.

e) Controale:

1. controlul infectiozitãtii virusului;

2. controlul toxicitãtii serului;

3. controlul culturii celulare neinoculate;

4. antiseruri de referintã.

f) Interpretare: cu virusul tulpinii NADL timpul optim pentru citire este dupã o incubare de 5 zile la temperatura de 37ºC.

g) Un titru de neutralizare mediu de 1/10 este considerat indicator al unei reactii imunitare la o infectie anterioarã acutã.

I. Depistarea mamitelor

Analiza laptelui va fi realizatã conform legislatiei în vigoare.

J. Febra aftoasã

1. Colectarea probelor de esofag/faringe si testarea lor se vor efectua conform urmãtorului protocol:

a) Reactivi: înainte de prelevare este preparat mediul de transport. Se distribuie un volum de 2 ml într-un numãr de containere egal cu numãrul de animale care vor fi testate.

Containerele trebuie sã reziste la congelare cu CO2 solid sau azot lichid. Probele se obtin cu ajutorul unui aparat de recoltat saliva sau prin tehnica “probang”. Pentru a obtine o probã se plaseazã sonda în gurã sub limbã si în partea superioarã a esofagului. Se încearcã frecarea/raclarea suprafetei epiteliului din partea superioarã a esofagului si faringelui prin miscãri laterale si dorsale. Dispozitivul probang este retras, de preferintã, dupã ce animalul a înghitit.

Sonda trebuie sã fie plinã si sã continã un amestec de mucus, salivã, fluid esofagian si fragmente celulare. Se vor lua mãsuri ca fiecare specimen sã continã material celular vizibil. Se vor evita miscãrile bruste, care pot provoca sângerãri.

Probele prelevate de la anumite animale pot fi puternic contaminate cu continut ruminal. În acest caz probele sunt îndepãrtate si se spalã gura animalului cu apã sau cu lichid fiziologic înainte de repetarea operatiei.

b) Tratarea probelor: se examineazã calitatea fiecãrei probe colectate în dispozitivul probang si se adaugã 2 ml într-un volum egal cu mediul de transport într-un container rezistent la congelare. Containerele sunt închise ermetic, sigilate, dezinfectate si etichetate. Probele sunt tinute la rece la temperatura de +4ºC si examinate dupã 3-4 ore sau plasate în gheatã uscatã la temperatura de -69ºC sau în azot lichid si pãstrate în stare congelatã pânã la exami- nare. Între douã prelevãri se spalã si se clãteste dispozitivul probang de 3 ori cu apã curatã.

c) Testarea virusului FMD: probele sunt inoculate în culturi de celule primare bovine tiroidiene, folosindu-se cel putin 3 tuburi la o prelevare. Pot fi folosite alte celule asemãnãtoare, precum celule primare de rinichi de bovine sau porcine, dar trebuie retinut cã aceste celule sunt mai putin sensibile la anumite tulpini de FMDV. Tuburile sunt inoculate la temperatura de 37ºC într-un aparat de rulare si sunt examinate zilnic timp de 48 de ore pentru detectarea prezentei efectului citopatic (CPE). Dacã sunt negative, culturile sunt plasate în alte culturi si reexaminate timp de 48 de ore. Se va confirma specificitatea tuturor CPE.

d) Mijloace de transport recomandate:

1. tampon fosfat de 0,08 M, pH 7,2, continând 0,01% albuminã de ser bovin, 0,002% rosu de fenol si antibiotice;

2. mediu de culturã tisularã (Eagle’s MEM) continând tampon Hepes de 0,04 M, 0,01% albuminã de ser bovin si antibiotice, pH 7,2.

e) La mediul de transport trebuie adãugate antibioticele (la ml final):

1. penicilinã 1.000 u.i.;

2. sulfat de neomicinã 100 u.i.;

3. sulfat de polimixinã B 50 u.i.;

4. micostatin 100 u.i.

2. Testul de seroneutralizare a virusului trebuie efectuat conform urmãtorului protocol:

a) Reactivi: se preparã antigenul FMDV de stoc în culturi celulare sau pe limbã de bovinã si se pãstreazã la temperatura de 70ºC, mai micã sau la temperatura de -20ºC dupã adãugarea a 50% glicerol. Acesta constituie antigenul stoc. În aceste conditii FMDV este stabil si titrurile variazã foarte putin pe o perioadã de câteva luni.

b) Procedura: testul este realizat pe plãci de microtitru cu fund plat, prevãzute pentru culturi celulare, folosind celule sensibile ca IB-RS-2, BHK-21 sau celule de rinichi de vitel.

Serurile de testat sunt diluate 1/4 într-un mediu de culturi celulare fãrã ser, la care se adaugã 100 u.i./ml neomicinã sau alte antibiotice adecvate. Serurile sunt inactivate la temperatura de 56ºC timp de 30 de minute si se folosesc volume de 0,05 ml pentru prepararea unor serii duble pe plãci de microtitru utilizând 0,05 ml verigi diluante. Se adaugã apoi în fiecare godeu virus pretitrat, diluat în mediu de culturã fãrã ser, continând 100 TCID50/0,05 ml. Dupã incubare la temperatura de 37ºC timp de o orã pentru a permite reactia de neutralizare se adaugã în fiecare godeu 0,05 ml de suspensie celularã ce contine 0,5-1,0 x 106 celule la ml într-un mediu de culturã celularã continând ser fãrã anticorpi la FMD, dupã care plãcile sunt sigilate.

Plãcile sunt incubate la temperatura de 37ºC. Monoculturile devin normal confluente în 24 de ore. CPE este în mod normal suficient de dezvoltat la 48 de ore pentru a permite o citire microscopicã a testului. În acest moment se poate efectua o citire microscopicã finalã sau plãcile pot fi fixate si colorate în vederea unei citiri macroscopice, utilizându-se, de exemplu, 10% formol si 0,05% albastru de metilen.

c) Controale: controalele fiecãrui test cuprind antiserul corespunzãtor al titrului cunoscut, controlul celulelor, controlul toxicitãtii serului, controlul mediului si titrul virusului de la care se calculeazã cantitatea realã a virusului continutã în test.

d) Interpretare: godeurile care prezintã CPE sunt considerate infectate si titrurile de neutralizare sunt exprimate ca reprezentând reciproca dilutiei finale de ser prezent în amestecurile de ser-virus la punctul final de 50% estimat dupã metoda Spearman-Karber.

e) Testele sunt considerate valide dacã cantitatea realã de virus folositã la godeu este cuprinsã între 101,5 si 102,5 TCID50 si dacã titrul serului de referintã se gãseste într-o zonã dublã a titrului anticipat, estimat dupã modul de realizare a titrãrilor precedente. Când martorii se gãsesc în afara acestor limite se repetã probele. Un titru final de 1/11 sau inferior este considerat negativ.

3. Detectarea si cuantificarea anticorpului prin testul ELISA se va efectua conform urmãtorului protocol:

a) Reactivi: antiseruri de iepure împotriva antigenului 146S de 7 tipuri de virus ai febrei aftoase (FMDV) folosite la o concentratie optimã predeterminatã într-un tampon de carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se preparã antigeni din tulpinile de virus selectate, cultivate pe celule monocelulare BHK-21. Se utilizeazã supernatanti nepurificati, pretitrati conform protocolului, dar fãrã ser pentru a da o dilutie, care dupã adãugarea unui volum egal de PBST (lichid fiziologic tamponat cu fosfat, continând 0,05% Tween-20 si indicator rosu fenol) ar da o intensitate opticã între 1,2 si 1,5. Virusurile pot fi folosite inactivate. PBST este folosit ca diluant. Se preparã serurile de cobai prin inocularea cobailor cu antigen 146S din fiecare serotip. Se preparã o concentratie optimã predeterminatã în PBST, ce contine 10% ser normal de bovinã si 5% ser normal de iepure. Se foloseste imunoglobulinã de iepure anticobai conjugatã cu peroxidazã din hrean la o concentratie optimã predeterminatã în PBST, ce contine 10% ser normal de bovinã si 5% ser normal de iepure. Serurile de testat sunt diluate în PBST.

b) Procedura:

1. Plãcile ELISA sunt acoperite cu 59 u.i. seruri antivirale de iepure si lãsate peste noapte într-o incintã umedã, la temperatura ambiantã.

2. Se preparã 50 µl de duplicat, serii duble din fiecare ser de testat începând cu 1/4 în plãci cu multe godeuri si cu fundul în formã de U (plãci purtãtoare). Se adaugã în fiecare godeu 50 µl dintr-o dozã constantã de antigen si se lasã amestecurile peste noapte la temperatura de 4ºC.

Adãugarea antigenului reduce dilutia sericã initialã la 1/8.

3. Se spalã plãcile ELISA cu PBST de 5 ori.

4. Se transferã apoi 50 µl din amestecurile ser-antigen din plãcile purtãtoare în plãcile ELISA acoperite cu ser de iepure si se incubeazã la temperatura de 37ºC timp de o orã pe un agitator rotativ.

5. Dupã spãlare se adaugã în fiecare godeu 50 u.i. de antiser de cobai la antigenul folosit la lit. d). Se incubeazã plãcile la temperatura de 37ºC timp de o orã pe un agitator rotativ.

6. Se spalã plãcile si se adaugã în fiecare godeu 50 µl de imunoglobulinã de iepure anticobai, conjugatã cu peroxidazã din hrean. Plãcile sunt incubate la temperatura de 37ºC timp de o orã pe un agitator rotativ.

7. Se spalã plãcile si se adaugã în fiecare godeu 50 u.i. de ortofenilen diaminã, ce contine 0,05% H2O2 30% p/v.

8. Dupã 15 minute se opreste reactia cu H2SO4 de 1,25 M. Se efectueazã citirea spectrofotometricã a plãcilor la 492 nm cu ajutorul unui cititor ELISA, cuplat la un microordinator.

c) Controale: pentru fiecare antigen utilizat 40 de godeuri nu contin ser, ci antigen diluat într-un PBST:

1. o serie dublã de douã dilutii de antiser bovin omolog de referintã;

2. o serie dublã de douã dilutii de ser bovin negativ.

d) Interpretare: titrurile anticorpilor sunt exprimate ca reprezentând dilutia finalã a serurilor de testat, dând 50% din valoarea medie OD înregistratã în godeurile de control al virusului în absenta serului de testat. Titrurile superioare valorii de 1/40 sunt considerate pozitive.

CAPITOLUL III

Porcine

A. Tuberculozã

Testul tuberculinic intradermic, care utilizeazã tuberculina aviarã, trebuie efectuat în conformitate cu procedurile din cap. II lit. A pct. 1, cu exceptia faptului cã locul injectiei va fi pielea finã de la baza urechii.

B. Brucelozã

Testul de seroaglutinare si de fixare a complementului va fi efectuat în conformitate cu cap. II lit. B pct. 1 si 2.

C. Boala lui Aujeszky

Testul de seroneutralizare se va efectua în conformitate cu urmãtorul protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încãlzire la temperatura de 56ºC timp de 30 de minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant pe diferite plãci de microtitru foloseste sisteme celulare Vero sau alte sisteme celulare senzitive. Virusul bolii lui Aujeszky este utilizat la 100 TCID50 per 0,025 ml; probele de seruri inactivate, nediluate, sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie de virus. Amestecul virus-ser este incubat timp de douã ore la temperatura de 37ºC în plãci de microtitru înainte de adãugarea celulelor potrivite. Celulele sunt utilizate într-o concentratie, care formeazã dupã 24 de ore un monostrat complet.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitãtii virusului;

2. controlul toxicitãtii serului;

3. controlul culturilor celulare neinoculate;

4. referinta antiserului.

d) Interpretare: rezultatele testului de neutralizare si titrul virusului utilizat în test se înregistreazã dupã 3-7 zile de incubare la temperatura de 37ºC. Dacã titrul serului este mai putin de jumãtate (material seminal nediluat) testul este considerat negativ.

D. Gastroenterita transmisibilã (TGE)

Testul de seroneutralizare va fi efectuat în conformitate cu urmãtorul protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încãlzire la temperatura de 56ºC timp de 30 de minute înaintea utilizãrii.

b) Procedura: testul de seroneutralizare pe plãci de microtitru foloseste celule A72 (tumori de câine) sau alte sisteme celulare sensibile. Virusul TGE se foloseste la 100 TCID50 per 0,025 ml; probele de ser inactivate, nediluate, sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie viralã. Amestecul virus-ser este incubat 30-60 minute la temperatura de 37ºC în plãcile de microtitru înainte de a se adãuga celulele potrivite. Celulele sunt utilizate într-o concentratie, care dupã 24 de ore formeazã un monostrat complet. Fiecare celulã primeste 0,1 ml de suspensie celularã.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitãtii virusului;

2. controlul toxicitãtii serului;

3. controlul celulelor neinoculate;

4. referinte antiser.

d) Interpretare: rezultatele testului de seroneutralizare si titrul virusului utilizat în test sunt înregistrate dupã o incubare de 3-5 zile la temperatura de 37ºC. Dacã titrul serului este mai putin de jumãtate (dilutie finalã), testul este considerat negativ. Dacã probele de ser nediluat sunt toxice pentru tesuturile de culturã, aceste seruri pot fi diluate 1/2 înainte de a fi utilizate în test. Acesta corespunde unei dilutii finale a serului de 1/4. La titrul serului mai putin de 1/4 (dilutie finalã) testul este considerat negativ.

E. Influenta suinã

Testul de inhibare a hemaglutinãrii se va efectua conform urmãtorului protocol:

a) Procedura: testul se realizeazã prin metode standard pentru distrugerea inhibitorilor nespecifici; serurile suine ar trebui tratate fie cu o enzimã care distruge receptorii (filtrat de Vibrio Cholerae), incubatã peste noapte la temperatura de 37ºC, acest tratament fiind urmat de o reîncãlzire la temperatura de 37ºC timp de 30 de minute pentru distrugerea întregii activitãti reziduale enzimatice, fie cu 25% kaolinã, pãstratã pe durata noptii la temperatura de 4ºC.

Dupã absorbtia cu o suspensie de eritrocite de pasãre 10% incubatã timp de o orã la temperatura de 37ºC, serurile sunt testate cu ajutorul a 4 unitãti hemaglutinante ale virusului respectiv, utilizându-se eritrocite de pasãre 1%.

Virusul si serul se lasã în contact timp de 60 de minute la temperatura camerei înainte de adãugarea eritrocitelor.

b) Interpretare: titrurile de 1/10 sau mai mari sunt considerate pozitive.

F. Febra aftoasã

Testele pentru febra aftoasã la porcine se vor efectua conform protocoalelor stabilite în cap. II lit. J.

G. Boala veziculoasã a porcului

Testul de seroneutralizare se va efectua conform urmãtorului protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încãlzire la temperatura de 56ºC timp de 30 minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant variabil pe plãci de microtitru foloseste celule IB-RS-2 sau alte sisteme celulare senzitive G27/72 sau orice alt tip de tulpinã utilizatã la 100 TCID50 per 0,025 ml. Serurile testate sunt diluate 1/4 si inactivate, apoi se preparã douã serii de dilutii. Probele de ser sunt amestecate cu un volum egal de suspensie viralã si incubate timp de o orã la temperatura de 37ºC în plãcile de microtitru înainte de adãugarea a 0,025 ml suspensie celularã continând 3 x 106 celule/ml.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitãtii virusului;

2. controlul toxicitãtii serului;

3. controlul celulelor neinoculate;

4. referinta antiserurilor.

d) Interpretare: rezultatul testului si titrul virusului utilizat în test sunt înregistrate dupã 3-5 zile de incubare la temperatura de 37ºC. Titrul serului este considerat negativ dacã nu existã neutralizare la dilutia 1/11.

H. Pesta porcinã clasicã (PPC)

Recoltarea materialelor pentru diagnostic

1. Pentru izolarea virusului si detectarea antigenilor sunt considerate importante portiuni de tesut din splinã si amigdale. Este de dorit sã se recolteze încã cel putin alte douã tesuturi limfatice (cum ar fi: limfonodulii retrofaringieni, paratiroidieni, mandibulari sau mezenterici) alãturi de ileon sau rinichi. Fiecare probã de tesut va fi pusã într-o pungã de plastic separatã, sigilatã si etichetatã. Probele vor fi transportate si depozitate în containere etanse. Probele nu vor fi congelate, dar vor fi tinute la temperatura de refrigerare si supuse testãrii fãrã întârziere.

2. Probele de sânge pentru izolarea virusului din leucocite se vor recolta de la porci care au febrã sau care prezintã alte semne de boalã. Ca anticoagulant se va folosi EDTA sau heparina. Probele se pãstreazã la temperatura de refrigerare si se trimit la laborator fãrã întârziere pentru efectuarea testelor.

3. Probele de sânge pentru detectarea anticorpilor ca un ajutor pentru diagnosticul clinic în focar sau pentru supravegherea efectivelor vor fi recoltate de la animale care s-au însãnãtosit dupã ce au trecut prin infectii suspecte sau de la porci cunoscuti cã au avut contact cu animale infectate sau suspecte. În fiecare exploatatie suspectã tuturor animalelor dintre primele 20 suspecte de boalã sau suspecte cã au avut contact cu animale bolnave si la 25% din restul animalelor li se vor recolta probe de sânge. În ideea asigurãrii unei foarte mari probabilitãti de detectare a anticorpilor probele vor fi recoltate din fiecare unitate a exploatatiei.

Diagnosticul de laborator al PPC

1. Bazele diagnosticului de laborator al PPC constau în evidentierea antigenilor virali, a virusului sau a anticorpilor prezenti în organe ori fluide tisulare.

2. În cazul unor rezultate neconcludente testele vor fi repetate pe aceleasi probe. Dacã suspiciunile clinice continuã, se vor recolta probe suplimentare din aceleasi surse.

3. Testele serologice pentru evidentierea anticorpilor pot fi folosite ca un criteriu secundar de diagnostic al cazurilor suspecte de PPC. Dacã evidentierea antigenilor virali sau izolarea virusului nu s-a putut realiza pe materialele provenite de la animale care au dat nastere suspiciunii de PPC sau cu materiale din exploatatii care au avut contact cu cazuri de PPC, testele pentru evidentierea anticorpilor se vor efectua pe probe de sânge de la animale care nu mai sunt suspecte si de la animale suspecte de a fi avut contact cu boala.

Evidentierea antigenului viral

1. Pentru evidentierea antigenului viral din portiuni de tesut din organe din tesuturi imunocompetente trebuie sã fie utilizatã tehnica prin care se obtin sectiuni subtiri la criostat de pânã la 5 microni, din tonsile sau din alte organe mentionate la titlul “Recoltarea materialelor pentru diagnostic”.

Reagentul de diagnostic trebuie sã fie un antiser policlonal specific - pestivirus - pentru virusul PPC, marcat cu fluorocrom (marcaj luminiscent), cu o enzimã sau cu biotinã, în conformitate cu urmãtoarele criterii:

a) serul hiperimun va fi preparat de la porci care sunt liberi de infectii, iar serul lor nu contine nici un fel de anticorpi care ar putea afecta specificitatea sau calitatea reactiilor;

b) imunoglobulinele marcate, preparate din ser hiperimun PPC de porc, dupã cum se mentioneazã la lit. a), vor avea un titru minim de lucru de 1/20, determinat pe culturi celulare infectate cu virusul PPC si confirmat prin teste de verificare pe sectiuni de tesut. Dilutia de lucru a conjugatului trebuie sã combine maximum de semnal cu minimum de colorare a fondului.

2. Orice probã care indicã o reactie citoplasmaticã specificã va fi consideratã pozitivã pentru pestivirus. În asemenea cazuri testele ulterioare trebuie efectuate conform descrierii de la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri”.

Izolarea virusului si identificarea în culturi celulare 1. Izolarea virusului din probe de tesut se face pe culturi celulare sensibile PK 15 sau pe alte linii celulare la fel de sensibile (susceptibile). Suspensia din organul provenit de la animalul suspect se va inocula la dilutia de 1/10.

2. Izolarea virusului din probe de sânge, recoltat si manipulat dupã cum este indicat la titlul “Recoltarea materialelor pentru diagnostic”, se realizeazã prin inocularea culturilor celulare cu o suspensie de globule albe, reconstituitã pânã la volumul original de sânge.

3. Pentru detectarea antigenului viral în citoplasma inoculatelor aceste culturi celulare trebuie tratate cu un antiser policlonal marcat. Colorarea trebuie sã se realizeze la intervale de 24 si 72 de ore din momentul inoculãrii.

4. Culturile pozitive trebuie sã facã obiectul testelor de diagnostic diferential, dupã cum se specificã la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri”. Rezultatele negative dupã primul pasaj pe culturi celulare determinã efectuarea unui al doilea pasaj sau chiar a mai multor pasaje pentru izolarea virusului.

Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali

1. Duplicatele sectiunilor tisulare criostatice sau ale culturilor celulare care prezintã reactii pozitive cu serul policlonal antivirus descris la titlurile “Evidentierea antigenului viral” si “Izolarea virusurilor si identificarea în culturi celulare” vor fi examinate din nou cu ajutorul anticorpilor monoclonali marcati, pentru a diferentia virusul PPC de virusul diareei virale bovine sau al bolii mucoaselor (BVD/MD).

2. Trebuie sã se utilizeze numai anticorpii monoclonali recomandati oficial de cãtre laboratorul comunitar de referintã pentru pesta porcinã clasicã.

3. Anticorpii monoclonali trebuie sã fie grupati în 4 liste, conform urmãtoarelor criterii:

Numãrul grupei Reactivitate

1........................ Toate virusurile pestoase

2........................ Toate virusurile PPC

3........................ Suse ale vaccinului contra PPC

4........................ Toate virusurile BVD/MD

Fiecare listã poate fi reprezentatã fie printr-un singur anticorp monoclonal, fie de un melanj de anticorpi monoclonali, astfel încât spectrul de reactivitate sã corespundã celui indicat anterior.

4. Interpretarea profilului reactiei poate fi rezumatã astfel:

Tabel	Interpretare
1 2 3 4
+ + - -	PPC confirmat
+ + + -	PPC tulpinã vaccinalã
+ - - +	Virus BVB/MD

Detectarea anticorpilor antivirali ai pestei porcine clasice

1. Detectarea anticorpilor antivirali PPC în esantioanele de sânge se efectueazã pentru a veni în sprijinul diagnosticãrii pestei porcine în unitãti cu porci care prezintã semne clinice de boalã sau pentru a decela boala la porcii recunoscuti a fi avut contacte cu porci infectati. Aceastã probã poate fi efectuatã în egalã mãsurã la sfârsitul perioadei de supraveghere sau pentru a controla efectivele al cãror statut este necunoscut.

2. Pentru aceasta, probele de sânge trebuie sã fie supuse unui test aprobat. Urmãtoarele teste sunt aprobate pentru utilizare si trebuie sã comporte includerea serurilor de control pozitive si negative. Susele de virus de utilizat pentru testele serologice trebuie sã fie agreate de laboratorul de referintã comunitarã pentru pesta porcinã clasicã.

Testul de neutralizare a virusului

1. Acest test se bazeazã pe determinarea titrului neutralizant 50% final. Se inoculeazã culturile cu un amestec din serul diluat si o cantitate constantã de virus dupã o perioadã specificã de incubare la temperatura de 37ºC.

Rezultatele se bazeazã pe absenta unei replicãri virale detectabile printr-un sistem de anticorpi marcati. Se poate utiliza fie testul de neutralizare - imunofluorescentã, fie de neutralizare - imunoperoxidazã.

2. În scopul detectãrii se vor dilua initial serurile 1/10.

Dacã este necesarã o titrare completã, se preparã dilutii ale serului în baza doi începând cu dilutia 1/10. Fiecare dilutie se amestecã cu un volum egal de suspensie de virus care contine 100 .10,5 10 g 10 doze infectante” “TCID50”. Se utilizeazã pentru fiecare dilutie cel putin douã culturi. Dupã o perioadã corespunzãtoare de incubare culturile celulare se fixeazã si antigenul viral se poate detecta printr-un procedeu de colorare cu ajutorul anticorpilor marcati. Rezultatele se exprimã prin reciproca dilutiei initiale a serului pentru care jumãtate din culturile de cellule inoculate nu prezintã coloratie specificã. Se estimeazã titrul la zona dintre douã dilutii.

Metoda imunoenzimaticã (ELISA)

1. Se pot utiliza pe orice suport adecvat tehnici competitive, prin blocaj sau indirecte, pentru ca testele utilizate sã reducã la minimum reactiile încrucisate cu virusul diareei virale bovine si cu alte pestivirusuri. Totusi sistemul de testare trebuie sã garanteze identificarea tuturor infectiilor datorate PPC si a tuturor stadiilor rãspunsului imunitar fatã de infectie.

2. Antigenul trebuie sã provinã din proteine virale ale unuia dintre susele recomandate de virus al PPC sau care sã îi corespundã. Celulele utilizate la prepararea antigenului trebuie sã fie indemne fatã de orice infectie indusã de pestivirusuri.

3. Antiserurile policlonale pentru probele prin competitie sau prin blocare trebuie sã se producã pe porci sau iepuri infectati cu una dintre susele recomandate ale virusului PPC sau prin susa C lapinizatã. Anticorpii monoclonali trebuie sã fie dirijati contra unei proteine virale imunodominante a virusului PPC sau sã îi corespundã acesteia.

4. Testele indirecte trebuie sã utilizeze un ser antiimunoglubuline de porc care sã detecteze IgG si IgM.

5. Sensibilitatea testului ELISA trebuie sã fie suficient de ridicatã pentru a da o reactie pozitivã cu toate serurile active în testul de neutralizare, precum si cu serurile pozitive de referintã furnizate de laboratorul comunitar de referintã pentru PPC.

6. Metoda ELISA nu poate fi utilizatã decât cu probe de ser sau plasmã care sã provinã de la porci individuali.

7. Dacã metoda ELISA nu este specificã PPC, probele pozitive trebuie sã facã obiectul testelor diferentiale suplimentare, asa cum sunt descrise la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri”.

Evaluarea rezultatelor testelor de laborator

1. Punerea în evidentã a antigenului virusului PPC în tesuturile organelor sau în culturi celulare dupã izolarea virusului din esantionul de tesut conform tehnicilor descries la titlurile: “Evidentierea antigenului viral”, “Izolarea virusului si identificarea în culturi celulare” si “Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali” constituie baza confirmãrii prezentei bolii, în afarã de cazul în care se demonstreazã cã reactia se datoreazã virusului vaccinal definit în conformitate cu titlul “Tipajul pestivirusurilor isolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali”. Punerea în evidentã a antigenului anti-BVD/MD în conformitate cu titlul “Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali” infirmã suspiciunea de PPC, precum si faptul cã suspiciunea nu se bazeazã pe alte cauze. În cazul unor rezultate neobisnuite sau neasteptate ale tipizãrii prin anticorpi monoclonali, conform titlului “Tipajul pestivirusurilor isolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali”, componentele de pestivirus izolate trebuie sã fie considerate neclasificate, iar efectivul de origine este considerat suspect pânã la efectuarea altor teste. Virusul se va trimite laboratorului comunitar de referintã în scopul caracterizãrii si al realizãrii anchetelor serologice în efectivele de origine.

2. În cazul detectãrii anticorpilor care reactioneazã cu virusul PPC efectivul de origine va fi considerat suspect.

a) Pentru a infirma suspiciunea de PPC care poate sã aparã prin detectarea anticorpilor, testul descris la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri” se utilizeazã pentru a stabili o distinctie între anticorpii care reactioneazã la PPC, susceptibili de a fi indusi de alte pestivirusuri, si anticorpii virusului PPC, indusi chiar de acesta. Toate probele originale trebuie sã facã obiectul unui test diferential.

b) Dacã suspiciunea nu poate fi exclusã cu ocazia primului test diferential, trebuie efectuat un alt test cu cel putin 30 de zile mai târziu, pentru a detecta o posibilã propagare a infectiei. Se vor ridica probe de la primele 20 de animale din ferma suspectã si de la 25% dintre animalele rãmase în efectiv.

Interpretarea rezultatelor serologice

1. Un titru de neutralizare a virusului superior sau egal cu 1/10 la oricare dintre porci, asociat cu un parametru clinic sau epizootologic care sã permitã sã se suspecteze boala, constituie un diagnostic pozitiv. Un titru superior sau egal cu 1/10 la oricare dintre porcii care nu se asociazã cu nici un simptom clinic sau epizootologic permite suspectarea bolii si trebuie sã fie urmat de un diagnostic diferential.

2. Aceleasi criterii trebuie sã fie aplicate oricãrui porc care prezintã un rezultat pozitiv la testul ELISA.

Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri

1. Testele pentru diagnosticul diferential între PPC si alte infectii induse de un pestivirus se bazeazã pe titrãri în paralel ale serului, utilizându-se atât suse de virusuri PPC, cât si suse de virusuri BVD/MD si folosindu-se metode strict comparabile.

a) Susele de virusuri PPC si de virusuri BVD/MD folosite au fost anterior aprobate oficial (conform titlului “Detectarea anticorpilor antivirali ai pestei porcine clasice”).

Pentru a exclude orice suspiciune de PPC datoratã detectãrii de anticorpi, esantioanele sanguine vor fi examinate prin titrarea comparativã a anticorpilor virusului PPC si virusurilor BVD/MD.

b) În testul ELISA blocat se poate utiliza compararea dintre procentajele inhibate de cãtre antigenii PPC si BVD/MD.

2. Rezultatele testelor serologice comparative care utilizeazã suse de referintã de PPC si alte pestivirusuri vor fi interpretate astfel:

a) dacã testele comparative aratã cã mai mult de un porc prezintã anticorpi ai virusului PPC, dar nici un anticorp contra altor pestivirusuri, rezultatul testului este considerat pozitiv în ceea ce priveste PPC;

b) dacã testele comparative relevã cã titrurile în ceea ce priveste PPC sunt egale sau superioare titrurilor altor pestivirusuri la mai mult de un porc, se suspicioneazã PPC, iar diferentierea se efectueazã astfel:

1. acei porci care prezintã titruri neutralizante în ceea ce priveste virusul PPC superioare sau egale titrurilor neutralizante ale altor pestivirusuri vor fi sacrificati. Tesuturile lor si, dacã este vorba de gestante, fetusii vor fi supusi unei examinãri pentru punerea în evidentã a antigenului sau virusului PPC, conform procedurii descrise la titlurile: “Evidentierea antigenului viral”, “Izolarea virusului si identificarea în culturi celulare” si .Tipajul pestivirusurilor isolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali”;

2. dacã se deceleazã antigenul viral sau virusul PPC, se confirmã PPC;

3. dacã testarea vizatã la pct. 2 nu permite revelarea prezentei antigenului virusului PPC, unitatea va fi consideratã suspectã, pânã când o nouã serie de probe sanguine prelevate cu cel putin 30 de zile mai târziu va fi supusã unor noi teste comparative;

4. dacã aceste teste comparative ulterioare aratã cã toate animalele prezintã titruri neutralizante sensibil mai mari (de 4 ori sau mai mult) contra virusului BVD/MD/BD decât virusul PPC, suspiciunea se infirmã;

5. dacã unul sau mai multe animale prezintã un titru în ceea ce priveste PPC egal sau superior titrului dat de virusul BVD/MD, rezultatul se considerã pozitiv în ceea ce priveste PPC;

c) dacã titrurile în ceea ce priveste BVD/MD se prezintã astfel încât nu putem exclude posibilitatea prezentei PPC, unitatea va fi consideratã suspectã si va fi testatã din nou dupã minimum 30 de zile.

Diagnosticul diferential în pesta porcinã africanã

1. Pesta porcinã africanã (PPA) nu poate fi diferentiatã de pesta porcinã clasicã prin examene clinice sau postmortem. Aceste maladii trebuie luate în considerare în diagnosticul diferential al oricãrui sindrom hemoragic febril acut la porcine. Testele de laborator sunt esentiale pentru a face diferenta dintre cele douã maladii. Un diagnostic pozitiv într-o tarã indemnã de PPA trebuie sã se bazeze pe izolarea si identificarea virusului PPA. Baza principalã a diagnosticului de laborator în PPA trebuie sã o constituie punerea în evidentã a virusului, antigenului viral sau a anticorpilor în organe si secretiile tisulare. În cazul unor rezultate neconcludente sau negative, pentru mai putin de douã teste efectuate pe esantioane din animalele suspecte de PPA sau pe material care sã provinã din ferme care au fost în contact cu cazuri de PPA, se va preleva material suplimentar din aceeasi unitate si de la animale care au fost în contact cu boala.

2. Evidentierea antigenului viral

Pentru evidentierea antigenului viral, pentru examinarea sectiunilor fine criostatice din tesuturile organelor sau din materialul etalat ori a sedimentelor culturilor leucocitare se utilizeazã tehnica de imunofluorescentã directã sau alte tehnici asemãnãtoare. Metodele utilizate sunt similare celor descrise pentru PPC, cu exceptia faptului cã se folosesc reactivi specifici pentru PPA.

3. Izolarea si identificarea virusului

a) Testul de hemadsorbtie (HAD)

Testul de hemadsorbtie se efectueazã prin inocularea suspensiei tisulare 10% sau a sângelui colectat pe teren de la porcii suspecti în culturi leucocitare primare de porc sau prin prepararea unor culturi leoucocitare din sânge ce provine de la porci febrili, inoculate în laborator sau prelevate pe teren. Hemadsorbtia constã în aglutinarea unui mare numãr de eritrocite de porc la suprafata celulelor infectate si confirmã diagnosticul de PPA.

b) Inocularea porcilor

Se obtine un amestec format din picãturi din suspensii tisulare 10%, din care se inoculeazã pe cale intramuscularã câte 2 ml/porc, la 4 porci, dintre care 2 au fost vaccinati contra pestei porcine clasice si 2 nu au fost vaccinati. În fiecare zi se ia temperatura rectalã a animalelor pentru a se constata cresterea acesteia si debutul semnelor clinice, pe o perioadã de 21 de zile. În cazul aparitiei febrei se ridicã probe de sânge în vederea preparãrii culturilor leucocitare destinate testului de hemadsorbtie (“autorosette” si inocularea culturilor leucocitare primare de porc).

Dacã nu apare nici un simptom clinic, se iau probe de sânge în scopul detectãrii de anticorpi dupã o perioadã de observatie de 21 de zile.

c) Detectarea anticorpilor indusi de virusul PPA în probele de ser si în secretiile tisulare

Detectarea anticorpilor în probele de ser sau în secretiile tisulare se realizeazã pentru a contribui la diagnosticarea PPA în crescãtoriile cu porci care prezintã simptome clinice care permit suspectarea bolii sau la porcii recunoscuti a fi avut un contact cu porci infectati cu PPA.

Ea se poate efectua în scopul supravegherii sau anchetãrii în efectivele cu statut necunoscut. Pentru acest scop esantioanele ridicate sunt supuse unui test aprobat. Sunt agreate si trebuie sã se efectueze cu seruri-martor positive si negative corespunzãtoare urmãtoarele teste:

- testul de imunofluorescentã (IFI);

- ELISA.

I. Leptospiroza

Testele pentru leptospirozã la porcine se vor efectua în conformitate cu cap. II lit. F.

ANEXÃ

la norma sanitarã veterinarã

CONDITII MINIME

pentru autorizarea târgurilor de animale, fermelor de carantinã sau centrelor de colectare

în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tãri terte

1. Târgurile de animale, fermele de carantinã sau centrele de colectare vor fi supravegheate de un medic veterinar oficial.

2. Fiecare târg de animale, fermã de carantinã sau centru de colectare va fi situat în centrul unei zone cu diametrul de 20 km, în care, conform constatãrilor oficiale, cu cel putin 30 de zile înaintea folosirii lor ca târguri de animale, ferme de carantinã sau centre de colectare autorizate nu s-a înregistrat nici un faz de febrã aftoasã, iar în cazul celor pentru porcine nu s-a înregistrat nici un caz de pestã porcinã, boalã veziculoasã a porcului sau encefalomielitã enteroviralã porcinã.

3. Înainte de utilizare ele vor fi curãtate si dezinfectate cu un dezinfectant oficial autorizat de tara exportatoare ca eficient în controlul bolilor mentionate la pct. 2.

4. Târgurile de animale, fermele de carantinã sau centrele de colectare, în functie de capacitatea de cazare, trebuie sã aibã:

a) o amenajare destinatã exclusiv acestui scop;

b) spatii si instalatii corespunzãtoare pentru încãrcarea, descãrcarea si cazarea adecvatã a animalelor, la un standard corespunzãtor, pentru adãparea si furajarea lor si pentru a le administra orice tratament necesar; aceste spatii si instalatii trebuie sã fie usor de curãtat si dezinfectat;

c) utilitãti corespunzãtoare pentru inspectie;

d) utilitãti corespunzãtoare pentru izolare;

e) echipament corespunzãtor pentru curãtarea si dezinfectia încãperilor si camioanelor;

f) o zonã corespunzãtoare de depozitare pentru furaje, asternut si gunoi de grajd;

g) un sistem corespunzãtor pentru colectarea apei reziduale;

h) un birou pentru medicul veterinar oficial.

5. Târgurile de animale, fermele de carantinã sau centrele de colectare trebuie sã fie inspectate periodic pentru a se verifica dacã conditiile pentru autorizare continuã sã fie îndeplinite.

6. Proprietarul sau persoana responsabilã de târgul de animale, ferma de carantinã sau centrul de colectare trebuie sã înscrie într-un registru sau într-o bazã de date care va fi pãstratã pentru o perioadã de minimum 3 ani urmãtoarele informatii:

a) numele proprietarului, originea, data de intrare si de iesire, numãrul de identificare a bovinelor, numãrul de înregistrare a exploatatiei de origine sau a efectivului de origine a porcilor care intrã în târgul de animale, ferma de carantinã sau centrul de colectare si destinatia lor;

b) numãrul de înregistrare al transportatorului si numãrul de autorizatie al camionului care livreazã sau colecteazã animalele din târgul de animale, ferma de carantinã sau centrul de colectare.

7. Punctele de achizitii, spatiile de încãrcare sau alte spatii prin care pot trece bovinele ori porcinele destinate exportului vor satisface conditiile prevãzute la pct. 1, 2 si 3.

8. Toate porcinele si bovinele care trec prin târgul de animale, ferma de carantinã sau centrul de colectare autorizat trebuie sã fie identificate si sã îndeplineascã conditiile de sãnãtate stabilite pentru categoria de animale respectivã.

9. Animalele care vor fi exportate si care trec prin târgul de animale, ferma de carantinã sau centrul de colectare pot fi exportate dupã minimum 6 zile de la intrarea în fermã, dacã sunt îndeplinite conditiile sanitare veterinare si se respectã urmãtoarele conditii:

a) sã nu vinã în contact cu animale biongulate, altele decât bovine sau porcine care îndeplinesc conditiile de sãnãtate stabilite pentru importul categoriei de animale;

b) sã fie separate în transporturi astfel încât nici unul dintre ele sã nu continã animale pentru reproductie sau productie si animale pentru tãiere imediatã;

c) sã fie încãrcate în vehicule de transport sau containere care au fost initial dezinfectate cu un dezinfectant autorizat oficial în tara exportatoare, eficient în controlul bolilor mentionate la pct. 2;

d) mijlocul de transport trebuie astfel construit încât sã nu fie posibil ca fecalele, urina, paiele sau furajele sã curgã sau sã cadã din vehicule pe durata transportului.

10. În cazul în care în conditiile pentru export de animale în perioada de carantinã se pretinde sã se efectueze un test în cadrul perioadei specificate înainte de încãrcare, acea perioadã începe o datã cu ziua în care animalele au fost introduse în ferma de carantinã.

11. Tara exportatoare va autoriza târgurile de animale, fermele de carantinã sau centrele de colectare pentru animale de reproductie si productie, precum si pentru animale destinate tãierii si va notifica Comisiei Europene si autoritãtilor centrale competente ale statelor membre ale Uniunii Europene numele si adresa acestora.

12. Tara exportatoare va stabili procedura pentru supraveghere oficialã a târgurilor de animale, fermelor de carantinã sau centrelor de colectare, a bazelor de achizitie, a spatiilor de încãrcare si va asigura efectuarea unei astfel de supravegheri.

13. Tara exportatoare se asigurã ca informatiile referitoare la târgurile de animale, fermele de carantinã si centrele de colectare sã fie incluse în certificatul de sãnãtate care însoteste animalele exportate.

14. Târgurile de animale, fermele de carantinã sau centrele de colectare pentru export de bovine sau porcine din România cãtre statele membre ale Uniunii Europene vor fi autorizate conform legislatiei nationale. Dupã autorizare o copie de pe dosarul de autorizare, inclusiv o copie de pe autorizatie, este înaintatã autoritãtii veterinare centrale a României.

15. Autoritatea veterinarã centralã a României va înscrie târgul de animale, ferma de carantinã sau centrul de colectare în lista oficialã si va acorda un cod care va fi mentionat obligatoriu în certificatul de sãnãtate. Ferma de carantinã devine operationalã din momentul comunicãrii, respectiv acordãrii datelor si a codului din lista oficialã a autoritãtilor veterinare judetene.

16. România va aviza importul de bovine si porcine din tãri terte numai dacã acestea detin târguri de animale, ferme de carantinã sau centre de colectare aprobate de serviciile veterinare ale tãrii respective si transmise la Agentia Nationalã Sanitarã Veterinarã.

MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PÃDURILOR

ORDIN

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind conditiile generale de igienã în exploatatiile de animale producãtoare de lapte

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pãdurilor,

în temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitarã veterinarã nr. 60/1974, republicatã, cu modificãrile si completãrile ulterioare,

în baza Hotãrârii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Pãdurilor, cu modificãrile si completãrile ulterioare,

vãzând Referatul de aprobare nr. 157.971 din 24 iulie 2002, întocmit de Agentia Nationalã Sanitarã Veterinarã,

emite urmãtorul ordin:

Art. 1. - Se aprobã Norma sanitarã veterinarã privind conditiile generale de igienã în exploatatiile de animale producãtoare de lapte, prevãzutã în anexa care face parte integrantã din prezentul ordin.

Art. 2. - Agentia Nationalã Sanitarã Veterinarã, institutele centrale de profil si directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. - Agentia Nationalã Sanitarã Veterinarã va controla modul de aplicare a prevederilor prezentului ordin.

Art. 4. - La data intrãrii în vigoare a prezentului ordin se abrogã orice alte dispozitii contrare.

Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pãdurilor,

Ilie Sârbu

Bucuresti, 1 august 2002.

Nr. 346.

ANEXÃ

NORMÃ SANITARÃ VETERINARÃ

privind conditiile generale de igienã în exploatatiile de animale producãtoare de lapte

Art. 1. - Prezenta normã sanitarã veterinarã stabileste conditiile generale de igienã aplicabile în exploatatiile de animale producãtoare de lapte.

Art. 2. - În sensul prezentei norme sanitare veterinare, se întelege prin:

a) exploatatie de animale producãtoare de lapte - unitatea în care sunt tinute una sau mai multe vaci, oi, capre sau bivolite producãtoare de lapte;

b) autoritate veterinarã competentã - autoritatea veterinarã centralã, autoritatea veterinarã judeteanã si a municipiului Bucuresti, reprezentatã prin directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti, precum si autoritatea veterinarã localã reprezentatã prin circumscriptia sanitarã veterinarã pentru controlul alimentelor si circumscriptia sanitarã veterinarã zonalã, cu atributii în domeniul supravegherii si controlului sanitar-veterinar;

c) autoritate veterinarã centralã - autoritatea veterinarã centralã a României, reprezentatã prin Agentia Nationalã Sanitarã Veterinarã din cadrul Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Pãdurilor.

Art. 3. - Autoritatea veterinarã competentã se va asigura cã toate exploatatiile de animale producãtoare de lapte corespund conditiilor stabilite în anexa care face parte integrantã din prezenta normã sanitarã veterinarã.

Art. 4. - Autoritatea veterinarã centralã poate stabili conditii suplimentare de igienã în exploatatiile de animale producãtoare de lapte.

ANEXÃ

la norma sanitarã veterinarã

CONDITII GENERALE

de igienã aplicabile în exploatatiile de animale producãtoare de lapte

CAPITOLUL I

Conditii generale de igienã pentru spatiile de cazare a animalelor

Spatiile pentru cazarea animalelor vor îndeplini urmãtoarele conditii de igienã:

1. spatiile în care sunt cazate animalele producãtoare de lapte, precum si spatiile adiacente acestora trebuie sã îndeplineascã permanent conditiile constructive si sã fie mentinute în conditii de curãtenie si igienã corespunzãtoare;

2. accesul în spatiile în care sunt cazate animalele producãtoare de lapte, precum si în spatiile adiacente acestora trebuie sã fie în permanentã stare de curãtenie, fãrã acumulãri de dejectii sau ape reziduale;

3. canalele de colectare a dejectiilor trebuie sã fie curãtate ori de câte ori este necesar;

4. grajdurile trebuie sã fie mentinute uscate, dacã este necesar, prin folosirea unui asternut pentru animale;

5. spatiul pentru muls, spatiul destinat depozitãrii laptelui, spatiile de spãlare si de depozitare, precum si echipamentele aferente acestor spatii trebuie sã fie mentinute permanent în conditii de curãtenie si igienã corespunzãtoare;

6. dezinfectia spatiilor de cazare a animalelor si a spatiilor adiacente acestora se executã astfel încât operatiunea sã nu prezinte risc de depreciere sau de contaminare a laptelui;

7. este interzisã cazarea altor specii de animale în spatiile de muls;

8. în spatiile în care sunt cazate animale, precum si în spatiile adiacente acestora toate insectele si animalele indezirabile vor fi combãtute prin metode eficiente;

9. a) nu este permisã depozitarea substantelor chimice de orice naturã, precum si a produselor biologice si medicamentoase în spatiile în care sunt cazate animale;

b) depozitarea substantelor chimice de orice naturã, precum si a produselor biologice si medicamentoase se face în spatii special amenajate, cu acces restrictionat;

10. nu este permisã depozitarea furajelor si a alimentelor care pot influenta calitatea laptelui în spatiile în care sunt cazate animale.

CAPITOLUL II

Conditii generale de igienã a echipamentelor si instrumentelor folosite la muls si la manipularea laptelui

Echipamentele si instrumentele folosite la muls si la manipularea laptelui vor îndeplini urmãtoarele conditii:

1. echipamentele si instrumentele trebuie sã fie mentinute permanent în stare de întretinere bunã si în conditii de igienã corespunzãtoare;

2. echipamentele si instrumentele se curãtã, se igienizeazã, se dezinfecteazã si se limpezesc cu apã potabilã, dupã care se depoziteazã într-un spatiu curat;

3. recipientele de depozitare a laptelui, dupã golire, igienizare si dezinfectare, se lasã cu unul dintre orificii deschis pânã la refolosire.

CAPITOLUL III

Conditii generale de igienã referitoare la muls

1. a) Fiecare animal trebuie sã fie individualizat pentru a fi identificat de cãtre autoritatea veterinarã competentã.

b) Animalele trebuie sã fie curate si bine întretinute.

c) Înaintea mulsului se face igiena glandei mamare si a zonelor adiacente acesteia, la fiecare animal.

2. Nu se permite nici o operatiune care ar putea avea efect nociv asupra laptelui, înainte si în timpul mulsului.

3. a) Înaintea mulsului efectiv operatorul inspecteazã aspectul laptelui, iar în cazul în care se constatã modificãri fizice ale acestuia, laptele va fi oprit de la livrare.

b) Animalele cu boli clinice ale glandei mamare se mulg, la terminarea mulsului, colectiv sau cu un echipament separat ori se mulg manual, iar laptele astfel obtinut se colecteazã separat si nu se livreazã.

4. Animalele în lactatie, cu afectiuni ale glandei mamare, se trateazã, numai dupã muls, cu substante cu actiune localã, spraiuri speciale sau în alt mod dispus de autoritatea competentã.

5. Personalul care efectueazã mulsul si manipuleazã laptele trebuie sã poarte echipament adecvat, conform normelor de igienã.

6. a) Personalul care executã mulsul trebuie sã aibã mâinile curate în permanentã. Mâinile se vor spãla înainte si în timpul mulsului ori de câte ori este necesar.

b) În acest scop, în apropierea locului de desfãsurare a mulsului trebuie sã existe facilitãti pentru spãlarea mâinilor si a bratelor.

c) Plãgile deschise si orice alte leziuni se acoperã cu pansamente rezistente la apã.

7. Dupã muls laptele se depoziteazã într-un spatiu separat.

8. Spatiile pentru depozitarea laptelui trebuie sã fie folosite numai pentru activitãti legate de manipularea laptelui si echipamentelor de muls.

9. Pe durata stationãrii în spatiile de cazare a animalelor recipientele pentru lapte se acoperã sau se transportã în spatii special amenajate.

10. a) Dacã laptele este filtrat în timpul mulsului, filtrul utilizat se înlocuieste sau se curãtã înainte de depãsirea capacitãtii sale de filtrare, ori de câte ori este necesar.

b) La fiecare muls se utilizeazã un filtru nou.

c) Este interzisã utilizarea ca filtru a materialelor textile.