MONITORUL OFICIAL AL ROMANIEI

 

P A R T E A  I

Anul XIV - Nr. 659         LEGI, DECRETE, HOTĂRÂRI SI ALTE ACTE         Joi, 5 septembrie 2002

 

SUMAR

 

HOTĂRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI

 

856. - Hotărâre privind evidenta gestiunii deseurilor si pentru aprobarea listei cuprinzând deseurile, inclusiv deseurile periculoase

 

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE

ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

 

147. - Ordin al ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantină sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tări terte

 

346. - Ordin al ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind conditiile generale de igienă în exploatatiile de animale producătoare de lapte

 

HOTĂRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI

 

GUVERNUL ROMÂNIEI

 

HOTĂRÂRE

privind evidenta gestiunii deseurilor si pentru aprobarea listei cuprinzând deseurile, inclusiv deseurile periculoase

 

În temeiul prevederilor art. 107 din Constitutia României si ale art. 181 alin. (1) din Ordonanta de urgentă a Guvernului nr. 78/2000 privind regimul deseurilor, aprobată cu modificări si completări prin Legea nr. 426/2001,

 

Guvernul României adoptă prezenta hotărâre.

 

Art. 1. - (1) Agentii economici care generează deseuri au obligatia să tină o evidentă a gestiunii acestora, în conformitate cu modelul prevăzut în anexa nr. 1, pentru fiecare tip de deseu.

(2) Datele centralizate anual privind evidenta gestiunii deseurilor se transmit autoritătilor publice teritoriale pentru protectia mediului, la cererea acestora.

Art. 2. - (1) Agentii economici autorizati să desfăsoare activităti de colectare, transport, depozitare temporară, valorificare si eliminare a deseurilor sunt obligati să tină evidenta gestiunii deseurilor conform art. 1 alin. (1) numai pentru deseurile generate în cadrul activitătilor proprii.

(2) Evidenta gestiunii deseurilor colectate, transportate, depozitate temporar, valorificate si eliminate se raportează de către agentii economici autorizati, mentionati la alin. (1), la solicitarea autoritătilor publice teritoriale pentru protectia mediului sau a altor autorităti ale administratiei publice centrale si locale care au atributii si răspunderi în domeniul regimului deseurilor, conform prevederilor legale.

Art. 3. - (1) Pentru evidenta la nivel national a gestiunii deseurilor autoritatea publică centrală de protectie a mediului organizează, împreună cu autoritătile publice teritoriale de protectie a mediului si cu alte institutii aflate în coordonare, raportarea statistică anuală în acest domeniu.

(2) Metodologia si sistemul de raportare care stau la baza cercetărilor statistice vor fi actualizate periodic de autoritatea publică centrală de protectie a mediului, în conformitate cu cerintele legale în vigoare.

(3) Datele centralizate anual, referitoare la gestionarea deseurilor, se păstrează de către autoritătile publice teritoriale de protectie a mediului într-un registru de evidentă o perioadă de minimum 3 ani.

Art. 4. - (1) Pentru evidenta gestiunii deseurilor se stabileste, în baza prevederilor anexelor nr. IA si IB la Ordonanta de urgentă a Guvernului nr. 78/2000 privind regimul deseurilor, aprobată cu modificări si completări prin Legea nr. 426/2001, lista cuprinzând deseurile, prevăzută în anexa nr. 2.

(2) Lista cuprinzând deseurile, prevăzută în anexa nr. 2, include si deseurile periculoase, stabilite în baza prevederilor art. 181 alin. (1) si ale anexelor nr. IC, ID si IE la Ordonanta de urgentă a Guvernului nr. 78/2000, aprobată cu modificări si completări prin Legea nr. 426/2001.

(3) Deseurile periculoase prevăzute în anexa nr. 2 sunt marcate cu un asterisc (*).

Art. 5. - (1) Tipurile de deseuri prevăzute în anexa nr. 2 sunt definite în mod individual printr-un cod complet format din 6 cifre.

(2) Titlurile si subtitlurile categoriilor de deseuri sunt definite printr-un cod format din două, respectiv din 4 cifre.

Art. 6. - Pentru încadrarea în anexa nr. 2 a unui deseu în mod individual, agentii economici au obligatia codificării acestora cu 6 cifre, după următoarea procedură:

a) se identifică activitatea generatoare de deseuri din cap. 01-12 sau 17-20;

b) se identifică subcapitolul în care se încadrează deseul;

c) se identifică, în cadrul subcapitolului, deseul în mod individual, conform codului corespunzător, format din 6 cifre, excluzându-se codurile terminate cu 99;

d) dacă deseul nu este identificat la cap. 01-12 sau 17-20, se examinează pentru identificarea deseului cap. 13, 14 si 15;

e) dacă deseul nu este identificat nici în cap. 13, 14 si 15, se examinează cap. 16;

f) dacă deseul nu este identificat nici în cap. 16, atunci se examinează pentru identificare codurile cu terminatia 99 - alte desuri, corespunzătoare activitătii din care provine deseul.

Art. 7. - Deseurile rezultate din colectarea ambalajelor, inclusiv amestecurile de ambalaje din materiale diferite, se încadrează la codul 15 01, si nu la codul 20 01.

Art. 8. - (1) Deseurile clasificate ca periculoase - deseurile marcate cu asterisc (*) - prezintă una sau mai multe dintre proprietătile periculoase din anexa nr. IE la Ordonanta de urgentă a Guvernului nr. 78/2000, aprobată cu modificări si completări prin Legea nr. 426/2001.

(2) Deseurile care au proprietătile prevăzute la H3 - H8, H10 si H11 din anexa nr. IE la Ordonanta de urgentă a Guvernului nr. 78/2000, aprobată cu modificări si completări prin Legea nr. 426/2001, sunt periculoase dacă au una sau mai multe dintre următoarele caracteristici:

a) temperatură de inflamabilitate 55ș C;

b) una sau mai multe substante clasificate ca foarte toxice, în concentratie totală 0,1%;

c) una sau mai multe substante clasificate ca toxice, în concentratie totală 3%;

d) una sau mai multe substante clasificate ca dăunătoare, în concentratie totală 25%;

e) una sau mai multe substante corosive clasificate ca R35, în concentratie totală 1%;

f) una sau mai multe substante corosive clasificate ca R34, în concentratie totală 5%;

g) una sau mai multe substante iritante clasificate ca R41, în concentratie totală 10%;

h) una sau mai multe substante iritante clasificate ca R36, R37 si R38, în concentratie totală 20%;

i) o substantă cunoscută ca fiind cancerigenă din categoria 1 sau 2, în concentratie 0,1%;

j) o substantă cunoscută ca fiind cancerigenă din categoria 3, în concentratie 1%;

k) o substantă toxică pentru reproducere din categoria 1 sau 2, clasificată ca R60 si R61, în concentratie 0,5%;

l) o substantă toxică pentru reproducere din categoria 3, clasificată ca R62 si R63, în concentratie 5%;

m) o substantă mutagenă din categoria 1 sau 2, clasificată ca R46, în concentratie 0,1%;

n) o substantă mutagenă din categoria 3, clasificată ca R40, în concentratie 1%.

(3) Pentru proprietătile periculoase prevăzute la alin. (2) se fac următoarele precizări:

a) se utilizează pentru proprietatea periculoasă H10 denumirea toxic pentru reproducere, definită în Ordonanta de urgentă a Guvernului nr. 200/2000 privind clasificarea, etichetarea si ambalarea substantelor si preparatelor chimice periculoase, aprobată si modificată prin Legea nr. 451/2001, pentru a se evidentia mai clar această proprietate periculoasă;

b) substantele sunt clasificate ca periculoase în conformitate cu prevederile Hotărârii Guvernului nr. 490/2002 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Ordonantei de urgentă a Guvernului nr. 200/2000 privind clasificarea, etichetarea si ambalarea substantelor si preparatelor chimice periculoase;

c) metal greu înseamnă orice compus al arsenului, cadmiului, cromului (VI), cuprului, plumbului, mercurului, nichelului, seleniului, staniului, stibiului, taliului si telurului, precum si acestea în formă metalică, în măsura în care sunt clasificate ca substante periculoase.

Art. 9. - Constituie contraventii si se sanctionează cu amendă de la 30 milioane lei la 75 milioane lei următoarele fapte:

a)      absenta evidentei gestiunii deseurilor;

b) înscrierea de date incorecte în evidenta gestiunii deseurilor;

c) neutilizarea codurilor deseurilor prevăzute în anexa nr. 2 pentru evidenta gestiunii deseurilor;

d) netransmiterea evidentei gestiunii deseurilor autoritătilor publice centrale si autoritătilor publice teritoriale de protectie a mediului.

Art. 10. - Constatarea contraventiilor si aplicarea sanctiunilor prevăzute la art. 9 se fac de către personalul împuternicit din cadrul autoritătii publice centrale de protectie a mediului si din cadrul autoritătilor publice teritoriale de protectie a mediului.

Art. 11. - Contraventiilor prevăzute la art. 9 le sunt aplicabile dispozitiile Ordonantei Guvernului nr. 2/2001 privind regimul juridic al contraventiilor, aprobată cu modificări si completări prin Legea nr. 180/2002.

Art. 12. - Anexele nr. 1 si 2 fac parte integrantă din prezenta hotărâre.

Art. 13. - Pe data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se abrogă Hotărârea Guvernului nr. 155/1999 pentru introducerea evidentei gestiunii deseurilor si a Catalogului European al Deseurilor, publicată în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 118 din 23 martie 1999.

 

PRIM-MINISTRU

ADRIAN NĂSTASE

Contrasemnează:

p. Ministrul apelor si protectiei mediului,

Ioan Jelev,

secretar de stat

Ministrul industriei si resurselor,

Dan Ioan Popescu

p. Ministrul agriculturii, alimentatiei si pădurilor,

Petre Daea,

secretar de stat

p. Ministrul sănătătii si familiei,

Radu Deac,

secretar de stat

Ministrul administratiei publice,

Octav Cozmâncă

 

Bucuresti, 16 august 2002.

Nr. 856.

 

ANEXA Nr. 1*)

 

EVIDENTA GESTIUNII DESEURILOR

 

Pagina 1

Pagina a 2-a

 

 

ANEXA Nr. 2*)

 

LISTA

cuprinzând deseurile, inclusiv deseurile periculoase

 

Pagina a 3-a

Pagina a 4-a

Pagina a 5-a

Pagina a 6-a

Pagina a 7-a

Pagina a 8-a

Pagina a 9-a

Pagina a 10-a

Pagina a 11-a

Pagina a 12-a

Pagina a 13-a

Pagina a 14-a

Pagina a 15-a

Pagina a 16-a

Pagina a 17-a

 

 

 

 

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

 

MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PĂDURILOR

 

ORDIN

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantină sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tări terte

 

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pădurilor,

în temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitară veterinară nr. 60/1974, republicată, cu modificările si completările ulterioare,

în baza Hotărârii Guvernului nr. 12/2001 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Pădurilor, cu modificările si completările ulterioare,

văzând Referatul de aprobare nr. 154.721 din 3 aprilie 2002, întocmit de Agentia Natională Sanitară Veterinară,

emite următorul ordin:

Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară veterinară privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantină sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tări terte, prevăzute în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. - Directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. - Agentia Natională Sanitară Veterinară va controla modul de aducere la îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. - Prevederile normei sanitare veterinare prevăzute la art. 1 vor fi respectate de România în cazul exporturilor de animale vii din speciile bovine si porcine în Uniunea Europeană, până când va deveni stat membru al Uniunii Europene.

Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, si va intra în vigoare în termen de 15 zile de la data publicării lui.

 

p. Ministrul agriculturii, alimentatiei si pădurilor,

Petre Daea,

secretar de stat

 

Bucuresti, 10 aprilie 2002.

Nr. 147.

 

ANEXĂ

 

NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ

privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a târgurilor de animale, fermelor de carantină sau centrelor de colectare în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tări terte

 

CAPITOLUL I

Dispozitii generale

 

Prezenta normă sanitară veterinară stabileste protocoalele de testare pentru tuberculoză, bruceloză, leucoză enzootică bovină, bluetongue (febra catarală), boala epizootică hemoragică, leptospiroză, rinotraheita bovina infectioasă/vulvovaginita pustulară infectioasă, diareea virală bovină, febra aftoasă, boala lui Aujeszky, gastroenterita transmisibilă, influenta suină, boala veziculoasă a porcului, pesta porcină clasică, precum si conditiile pentru autorizarea târgurilor de animale, fermelor de carantină sau centrelor de colectare pentru comertul cu animale din speciile bovine sau porcine destinate exportului.

 

CAPITOLUL II

Bovine

 

A. Tuberculoză

1. Următoarele teste vor fi recunoscute ca fiind teste oficiale de tuberculinare intradermică:

a) testul unic intradermic presupune o singură injectare a tuberculinei bovine;

b) testul comparativ intradermic solicită o injectare de tuberculină bovină si o injectare de tuberculină aviară, administrate simultan.

2. Doza de tuberculină injectată va fi:

a) nu mai mică de 2.000 UTC de tuberculină bovină;

b) nu mai mică de 2.000 u.i. de tuberculină aviară W15.

Volumul fiecărei doze injectate nu va depăsi 0,2 ml.

3. Testele de tuberculinare se vor efectua prin injectarea tuberculinei/tuberculinelor în pielea gâtului. Locurile de injectare vor fi situate la limita dintre treimea anterioară si cea mijlocie a gâtului. Când se injectează aceluiasi animal atât tuberculină bovină, cât si tuberculină aviară locul pentru injectarea tuberculinei aviare va fi la aproximativ 10 cm de linia superioară a gâtului si locul pentru injectarea tuberculinei bovine va fi cu aproximativ 12,5 cm mai jos, pe o linie paralelă cu linia umărului sau pe părti diferite ale gâtului; la animalele tinere la care nu există loc sufficient pe o singură parte a gâtului pentru a separa aceste locuri fiecare injectie va fi făcută pe câte o parte laterală a gâtului, în locuri identice situate în centrul treimii mijlocii a gâtului.

4. Tehnica tuberculinării si interpretarea reactiilor vor fi următoarele:

4.1. Tehnica tuberculinării: locul injectării va fi tuns si dezinfectat. Se va prinde între degetul mare si arătător un pliu al pielii din interiorul zonei tunse si dezinfectate, se va măsura cu sublerul si se va nota valoarea obtinută. Un ac scurt, steril, tăiat oblic si atasat la o seringă gradată continând tuberculină va fi introdus oblic în straturile mai profunde ale pielii. Apoi se va injecta doza de tuberculină.

O injectare corectă va fi confirmată prin palparea unei mici ridicături asemănătoare unui bob de mazăre la fiecare loc de injectare. Grosimea pliului pielii din fiecare zonă injectată va fi măsurată din nou după 72 de ore de la injectare si va fi notată.

4.2. Interpretarea reactiilor

4.2.1. Interpretarea reactiilor se va baza pe observatiile clinice si pe cresterea/cresterile înregistrată/înregistrate a/ale locurilor de injectare, la 72 de ore după injectarea tuberculinei.

a) Reactia este negativă dacă se observă doar o inflamare limitată, cu o crestere nu mai mare de 2 mm a grosimii pliului de piele, fără semne clinice ca edem difuz sau extins, transpiratie, necroze, dureri sau inflamatii ale canalelor limfatice din regiunea respectivă sau ale limfonodulilor.

b) Reactia este neconcludentă dacă nu se observă semne clinice precum cele mentionate la lit. a) si dacă cresterea pliului de piele este mai mare de 2 mm, dar mai mică de 4 mm.

c) Reactia este pozitivă dacă se observă semne clinice precum cele mentionate la lit. a) si b) sau dacă cresterea pliului de piele de la locul injectării este de 4 mm sau mai mare.

4.2.2. Interpretarea testelor oficiale de tuberculinare intradermică va fi următoarea:

4.2.2.1. Testul unic intradermic:

a) pozitiv: o reactie pozitivă ca cea definită la lit. c);

b) neconcludent: o reactie neconcludentă ca cea definită la lit. b);

c) negativ: o reactie negativă ca cea definită la lit. a).

4.2.2.1.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul unic intradermic vor fi supuse unui alt test după minimum 42 de zile.

4.2.2.1.2. Animalele care nu au reactionat negativ la acest al doilea test vor fi considerate ca fiind pozitive la test.

4.2.2.1.3. Animalele care au reactionat pozitiv la testul unic intradermic pot fi supuse unui test comparativ intradermic.

4.2.2.2. Testul comparativ intradermic pentru stabilirea si mentinerea statusului de efectiv oficial indemn de tuberculoză:

a) pozitiv: o reactie pozitivă la tuberculina bovină cu 4 mm mai mare decât reactia la tuberculina aviară sau prezenta semnelor clinice;

b) neconcludent: o reactie pozitivă sau neconcludentă la tuberculina bovină, care este cu 1-4 mm mai mare decât reactia la tuberculina aviară, si absenta semnelor clinice;

c) negativ: o reactie negativă la tuberculina bovină sau o reactie pozitivă ori neconcludentă la tuberculina bovină, dar care este egală sau mai mică decât o reactie pozitivă ori neconcludentă la tuberculina aviară, precum si absenta semnelor clinice în ambele cazuri.

4.2.2.2.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul comparativ intradermic vor fi supuse unui alt test după minimum 42 de zile. Animalele care nu au reactionat negativ la acest al doilea test vor fi considerate ca fiind pozitive.

4.2.3. Statutul de efectiv oficial indemn de tuberculoză poate fi suspendat si animalelor din efectiv nu li se va permite să ia parte la comertul intracomunitar până la rezolvarea statusului următoarelor animale:

a) animalele care au fost considerate neconcludente la testul unic intradermic de tuberculinare;

b) animalele care au fost considerate pozitive la testul unic intradermic în perioada de asteptare a retestării cu un test comparativ intradermic;

c) animalele care au fost considerate neconcludente la testul comparativ intradermic.

4.2.4. Atunci când legislatia sanitară veterinară solicită ca animalele să fie supuse unui test intradermic anterior miscării lor, testul va fi interpretat astfel încât nici un animal care prezintă o crestere a grosimii pliului de piele mai mare de 2 mm sau prezintă semne clinice să nu fie comercializat.

B. Bruceloză

1. Testele de seroaglutinare

1.1. Serul aglutinant standard trebuie să fie conform serului etalon preparat de Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Regatul Unic al Marii Britanii si Irlandei de Nord. Fiola trebuie să contină 1.000 u.i. aglutinante, obtinute prin liofilizarea a 1 ml ser bovin.

1.2. Aprovizionarea cu serul standard trebuie să fie asigurată prin Bundesgesudheitsand, Berlin.

1.3. Titrul aglutinant al serului trebuie să fie exprimat în unităti internationale/ml, de exemplu, serum X = 80 u.i./ml.

1.4. Citirile reactiei lente de seroaglutinare în tuburi trebuie făcute la nivelul unei aglutinări de 50% sau 75%, iar antigenul utilizat trebuie să fie titrat în conditii identice fată de un ser standard.

1.5. Valorile aglutinante ale diferitilor antigeni fată de serul standard trebuie să se încadreze în următoarele limite:

a) dacă citirea se face la 50% - între 1/600 si 1/1.000;

b) dacă citirea se face la 75% - între 1/500 si 1/750.

1.6. Pentru prepararea antigenului destinat seroaglutinării lente în tuburi trebuie folosite tulpinile Weybridge nr. 99 si USDA 1119 sau orice alte tulpini de sensibilitate echivalentă.

1.7. Mediile de cultură folosite pentru întretinerea tulpinilor de laborator, precum si pentru producerea antigenului trebuie să nu producă disociere bacteriană S-R, fiind preferabilă folosirea agarului cu cartof.

1.8. Emulsia bacteriană trebuie făcută în solutie salină fiziologică NaCl 0,85ä, fenolat 5%. Formolul nu trebuie folosit.

1.9. Institutul oficial responsabil de testarea oficială a antigenilor este Institutul de Diagnostic si Sănătate Animală, str. dr. Staicovici nr. 63, Bucuresti.

1.10. Antigenii pot fi livrati în formă concentrată cu conditia ca factorul de dilutie care trebuie utilizat să fie indicat pe eticheta flaconului.

1.11. Pentru efectuarea unei reactii de seroaglutinare trebuie preparate cel putin 3 dilutii pentru fiecare ser.

Dilutiile serului suspect trebuie efectuate de asa manieră încât citirea reactiilor la limita de infectie să fie făcută în tubul din mijloc. Dacă există o reactie pozitivă în acest tub, serul suspect contine minimum 30 u.i. aglutinante/ml.

2. Reactia de fixare a complementului

2.1. Serul standard este acelasi cu cel mentionat la pct. 1.1. Pe lângă continutul său în unităti internationale aglutinante, 1 ml din acest ser bovin liofilizat trebuie să contină 1.000 de unităti sensibilizante care fixează complementul. Aceste unităti sensibilizante sunt denumite unităti sensibilizante CEE.

2.2. Serul standard trebuie să fie asigurat prin Bundesgesundheitsand, Berlin.

2.3. Titrul de anticorpi al serului care fixează complementul trebuie să fie exprimat în unităti sensibilizante CEE (de exemplu: serul X = 60 de unităti sensibilizante CEE/ml).

2.4. Un ser continând 20 sau mai multe unităti sensibilizante CEE/ml (si anume o activitate egală cu 20% din cea a serului standard) trebuie să fie considerat pozitiv.

2.5. Serurile trebuie inactivate după cum urmează:

a) serul bovin: la temperatura de 56-60șC timp de 30-50 minute;

b) serul porcin: la temperatura de 60șC timp de 30-50 minute.

2.6. Tulpina Weybridge nr. 99 sau tulpina USDA 1119 trebuie să fie folosite la prepararea antigenului. Antigenul reprezintă o suspensie bacteriană în ser fiziologic 0,85% NaCl sau în solutie tampon Veronal.

2.7. Pentru efectuarea reactiei de fixare a complementului s-a convenit utilizarea unei doze de complement superioare dozei minime necesare unei hemolize totale.

2.8. La efectuarea reactiei de fixare a complementului este necesar să se efectueze de fiecare dată următoarele controale:

a)      controlul efectului anticomplementar al serului; 

b) controlul antigenului;

c) controlul eritrocitelor sensibilizate;

d) controlul complementului;

e) controlul sensibilitătii la declansarea reactiei, utilizându-se un ser pozitiv;

f) controlul specificitătii reactiei, utilizându-se un ser negativ.

2.9. Supravegherea si controlul oficial al serurilor standard si al antigenilor trebuie efectuate de organismul mentionat la pct. 1.9.

2.10. Antigenii pot fi livrati în stare concentrată, dar cu mentionarea factorului de dilutie pe eticheta flaconului.

C. Leucoza enzootică bovină

1. Testul de imunodifuzie în gel de agar pentru leucoză enzootică bovină (LEB)

1.1. Antigenul care va fi folosit în test trebuie să contină glicoproteine ale virusului LEB. Antigenul trebuie să fie standardizat împotriva unui ser standard (serul El) furni- zat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga.

1.2. Institutul oficial care trebuie să fie răspunzător de calibrarea antigenului standard de lucru din laborator împotriva serului standard oficial CEE (serul El) furnizat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga, este Institutul de Diagnostic si Sănătate Animală, str. dr. Staicovici nr. 63, Bucuresti.

1.3. Antigenii standard folositi în laborator trebuie supusi cel putin o dată pe an, în laboratoarele CEE mentionate la pct. 1.2, testării contra serului standard oficial al CE.

Separat de această standardizare antigenul din uz poate fi calibrat conform metodei de standardizare descrise mai jos.

1.4. Reagentii folositi sunt:

a) antigenul: trebuie să contină glicoproteine specifice ale virusului LEB, care au fost standardizate contra serului oficial al CEE;

b) serul de testat;

c) serul de control care este cunoscut ca pozitiv;

d) gel de agar: 0,8% agar, 8,5% NaCl, tampon Tris 0,05 M cu pH 7,2. O cantitate de 15 ml din acest gel trebuie introdusă într-o placă Petri cu diametrul de 85 mm, rezultând o grosime de 2,6 mm a agarului.

1.5. Modelul după care se realizează testul constă în tăierea în agar a 7 godeuri uscate, până la fundul plăcii;

modelul va consta într-un godeu central si 6 godeuri plasate circular în jurul acestuia după cum urmează:

a) diametrul godeului central = 4 mm;

b) diametrul godeurilor periferice = 6 mm;

c) distanta dintre godeul central si godeurile periferice = 3 mm.

1.6. Godeul central trebuie umplut cu antigen standard.

Godeurile periferice 1 si 4 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 2, 3, 5 si 6, cu serurile de testat.

Godeurile trebuie umplute până la disparitia meniscului.

1.7. Aceste rezultate au fost obtinute folosindu-se următoarele cantităti:

a) antigen - 32 ”l;

b) ser pozitiv - 73 ”l ser de control;

c) ser de testat - 73 ”l ser care este suspect.

1.8. Incubatia trebuie să dureze 72 de ore la o temperatură a camerei de 20-27șC, într-o încăpere închisă si umedă.

1.9. Testul poate fi citit la 24 si 48 de ore, dar rezultatul final nu poate fi obtinut înainte de 72 de ore.

a) Serul testat este pozitiv dacă formează o linie specifică de precipitare cu antigenul virusului LEB si o linie completă de identificare cu serul de control.

b) Serul testat este negativ dacă nu formează o linie specifică de precipitare cu antigenul virusului LEB si dacă nu curbează linia produsă de serul de control.

c) Reactia nu poate fi considerată concludentă dacă:

(i) curbează linia serului de control spre godeul cu antigenul virusului LEB, fără a forma o linie de precipitare vizibilă cu antigenul; sau

(ii) nu poate fi citită ca negativă sau pozitivă.

În reactiile neconcludente testul poate fi repetat folosindu-se un ser concentrat.

1.10. Orice altă configuratie sau model poate fi folosit cu conditia ca serul E4 diluat 1/10 în serul negativ să poată fi detectat ca fiind pozitiv.

1.1.1. Metoda pentru standardizarea antigenului (Solutii si materiale necesare)

1. 40 ml de agar 1,6% în tampon Tris/HCl 0,05% M cu pH 7,2 cu 8,5% NaCl;

2. 15 ml ser contra LEB, continând anticorpi doar pentru glicoproteinele virusului LEB, diluat 1/10 în tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;

3. 15 ml ser contra LEB având anticorpi doar pentru glicoproteinele virusului LEB, diluat 1/5 în tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;

4. 4 plăci Petri din plastic cu diametrul de 85 mm;

5. un perforator cu un diametru de la 4 mm până la 6 mm;

6. antigen de referintă;

7. antigenul care urmează să fie standardizat;

8. o baie de apă la temperatura de 56șC.

1.1.2. Mod de lucru

a) Se dizolvă agarul (1,6%) în tampon Tris/HCl, încălzindu-l cu atentie până la temperatura de 100șC. Se tine pe baia de apă timp de aproximativ o oră. De asemenea, se pun dilutiile de ser contra LEB pe o baie de apă.

b) Se amestecă 15 ml din solutia de agar la temperatura de 56șC cu 15 ml ser contra LEB (1/10), scuturând rapid si turnând 15 ml în fiecare dintre cele două plăci Petri. Se repetă această procedură cu serul contra LEB diluat 1/5.

c) Când agarul s-a întărit se vor practica godeurile si se va face adăugarea antigenilor după cum urmează:

1. plăcile Petri 1 si 3:

a) godeul A - antigen de referintă nediluat;

b) godeul B - antigen de referintă diluat 1/2;

c) godeurile C si E - antigen de referintă;

d) godeul D - antigen de testat nediluat;

2. plăcile Petri 2 si 4:

a) godeul A - antigenul de testat nediluat;

b) godeul B - antigenul de testat diluat 1/2;

c) godeul C - antigenul de testat diluat 1/4;

d) godeul D - antigenul de testat diluat 1/8.

1.1.3. Instructiuni suplimentare

a) Experimentul trebuie să fie efectuat cu două dilutii de ser 1/5 si 1/10 în scopul obtinerii precipitării optime.

b) Dacă diametrul precipitării este prea mic pentru fiecare dintre cele două dilutii, este necesară diluarea în continuare a serului.

c) Dacă diametrul precipitării este prea mare si neclar pentru fiecare dintre cele două grade de dilutie, atunci va trebui aleasă o dilutie mai mică a serului.

d) Concentratia finală a agarului trebuie să fie de 0,8%, iar cea a serurilor de 5% si, respectiv, 10%.

e) Se notează diametrele măsurate în următorul system de coordonate. Dilutia de lucru este cea la care s-a înregistrat acelasi diametru pentru antigenul de testat si antigenul de referintă.

D. Bluetongue (febra catarală)

1. Testul ELISA de blocare sau competitiv se va efectua conform următorului protocol:

a) Testul ELISA competitiv care utilizează anticorpul monoclonal 3-17-A3 este capabil să detecteze anticorpii tuturor serotipurilor cunoscute ale virusului bluetongue (BTV).

b) Principiul testului constă în întreruperea reactiei dintre antigenul BTV si un anticorp monoclonal specific de grup (3-17-A3) prin adăugarea dilutiilor de ser de testare.

Anticorpii de BTV prezenti în serul de testare blochează reactivitatea anticorpului monoclonal (ACM) si determină reducerea dezvoltării culorii scontate la adăugarea substratului enzimatic.

1.1. Materiale si reactivi:

1. plăci de microtitru cu suprafată plată;

2. antigen pregătit conform procedurii descrise mai sus;

3. tampon de blocare: 5% (w/v) lapte praf deshidratat Marvel, 0,1% (v/v) de tween-20 furnizat sub formă de sirop de polioxietilenă sorbiton monolaurat în PBS;

4. anticorp monoclonal: 3-17-A3 (furnizat sub formă de supernatant de cultură tisulară hybridomă), depozitat la temperatura de -20șC sau liofilizat, diluat 1/50 cu tampon de blocare înainte de folosire, dirijat contra polipeptidei p7 specifică grupului;

5. conjugat: globulină de iepure antisoarece (adsorbit si diluat), conjugată cu peroxidază din hrean si păstrată la loc întunecos la temperatura de 4șC;

6. substrat si cromogen: 0,2 g de ortofenil diamină (OPD) dizolvat într-un tampon de 2,553 g acid citric si 4,574 g disodiu hidrogenortofosfat dizolvat în 500 ml de apă distilată, divizată în alicote de 25 ml si păstrate la loc întunecos la temperatura de -20șC, cu 12 ”l/25 ml de peroxid de hidrogen (30% w/v) adăugat imediat înainte de utilizare;

ATENTIE! A se utiliza OPD cu atentie, a se purta mănusi din cauciuc, produs suspect de a fi mutagen.

7. acid sulfuric de 1 mol: 26,6 ml de acid sulfuric adăugat la 473,4 ml de apă distilată;

ATENTIE! Întotdeauna adăugati acidul peste apă, niciodată apa peste acid.

8. agitator orbital;

9. cititor de placă ELISA (testul poate fi citit vizual).

Antigen orb +  Control conjugat

Antigen + Mab

Control conjugat

Antigen + ser pozitiv + acm + conjugat

Seruri de testat

 

Antigen + conjugat

Antigen + acm + Conjugat

Antigen + Ser pozitiv + acm + Conjugat

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

Ser de testat

1/2

1/4

1/8

1/16

1/2

1/4

1/8

1/16

 

1.2. Protocolul testului:

Control orb: linia 1A-H este un control orb care contine antigen BTV si conjugat. Acesta poate fi folosit la etalonarea cititorului ELISA.

1.3. Control ACM: linia 2A-H este controlul anticorpului monoclonal si cuprinde antigen BTV, anticorp monoclonal si conjugat. Acesta reprezintă un control negativ. Media valorilor densitătii optice ale acestei linii de control reprezintă valoarea de inhibitie 0%.

1.4. Control pozitiv: linia 3A-H este controlul pozitiv.

Acesta cuprinde antigen BTV, dilutii de antiser pozitiv BTV, ACM si conjugat si este inclus pentru a indica faptul că testul este efectuat corespunzător si că trebuie să se obtină niveluri similare de inhibitie de la un test la altul.

1.5. Serurile de testare: în schema testului prezentată mai sus 18 seruri pot fi testate în dilutii de 1/2, 1/4, 1/8 si 1/16. Acest lucru oferă informatii asupra titrului de anticorpi din serurile de testare. Gama de dilutii poate fi lărgită pentru a obtine titruri finale de dilutii ale serului. Alternativ, H G F E D C B A pentru supraveghere serologică la scară largă, serurile pot fi testate într-o singură dilutie (1/4) sau în două dilutii œ si 1/4 ca test de control rapid.

1.6. Procedura:

1. Se diluează antigen BTV la concentratie pretitrată în PBS, se agită usor pentru a dispersa virusul agregat (dacă agitatorul nu este disponibil, se pipetează puternic) si se adaugă 50 ”l în toate godeurile plăcii ELISA. Se agită usor marginile plăcii pentru a se dispersa antigenul.

2. Se incubează la temperatura de 37șC timp de 60 de minute cu ajutorul unui agitator orbital. Se spală plăcile de 3 ori prin golirea si umplerea godeurilor cu PBS nesteril si se usucă cu ajutorul unei hârtii absorbante.

3. Se adaugă 50 ”l la fiecare godeu de tampon de blocare. Se adaugă serurile de testare si ser pozitiv în godeurile corespunzătoare si se diluează pe suprafata plăcii cu ajutorul unei pipete cu multiple canale. Nu se adaugă ser la controlul orb sau controlul acm.

4. Imediat după adăugarea serurilor de testare se adaugă acm în tamponul de blocare la dilutie pretitrată si se adaugă 50 ”l în toate godeurile plăcii, cu exceptia controlului orb.

5. Se incubează la temperatura de 37șC timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spală de 3 ori si cu PBS si se usucă cu ajutorul unei hârtii absorbante.

6. Se diluează concentratul de iepure antisoarece la 1/5.000 într-un tampon de blocare si se adaugă 50 ”l în toate godeurile plăcii.

7. Se incubează la temperatura de 37șC timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spală de 3 ori si cu PBS si se usucă cu ajutorul unei hârtii absorbante.

8. Se dizolvă OPD si imediat înainte de utilizare se adaugă 12 ”l de 30% apă oxigenată la fiecare 25 ml de OPD. Se adaugă 50 ”l în toate godeurile plăcii. Se lasă circa 10 minute să se dezvolte culoarea si se împiedică reactia de 1 ml acid sulfuric 50 ”l la godeu. Culoarea trebuie să se dezvolte în godeurile de control ACM si în acele godeuri care contin săruri fără anticorpi la BTV.

9. Se examinează si se înregistrează plăcile fie vizual, fie cu ajutorul unui cititor spectrofotometric.

1.7. Interpretarea rezultatelor:

a) Se calculează valoarea medie a OD după citirea controalelor acm. Aceasta reprezintă valoarea de inhibitie 0%. Citirile densitătii optice a serurilor de testare sunt exprimate ca valori inhibitoare procentuale, folosindu-se următoarea formulă:

OD în prezenta serului de testare

Valoarea de inhibitie procentuală = 100 x OD în absenta serului de testare

b) Valorile de inhibitie mai mari de 40% la o dilutie de ser de 1/4 sunt considerate pozitive. Citirea vizuală este posibilă având în vedere că inhibitia de 40% este cea mai mică valoare vizibilă.

1.8. Prepararea antigenului BTV ELISA:

1. Se spală de trei ori 10 roux de celule confluente bhk-21 cu un mediu Eagle fără ser si se infectează cu serotipul 1 de virus BTV într-un mediu Eagle fără ser.

2. Se incubează la temperatura de 37șC si se examinează zilnic pentru efectul citopatic (CPE).

3. Când efectul citopatic este evident în 80-90% din placa de celule din fiecare roux se recoltează virusul prin agitare pentru a detasa celulele rămase pe sticlă.

4. Se centrifughează la 2.000-3.000 rpm pentru a granula celulele.

5. Se îndepărtează supernatantul si se resuspendă celulele în circa 30 ml de PBS continând 1% sarkosyl si 2 ml de fluoridă fenolmetilsulfonil (tampon de distrugere a celu- lelor). Acest lucru poate cauza o gelificare a celulelor si se pot adăuga mai multe tampoane de distrugere a celulelor pentru a reduce acest efect.

ATENTIE! Fluorura fenolmetilsulfonil este toxică, a se utiliza cu extremă atentie!

6. Se disociază celulele timp de 60 de secunde cu ajutorul unei sonde ultrasonice la o amplitudine de 30 de microni.

7. Se centrifughează la 10.000 rpm timp de 10 minute.

8. Se stochează supernatantul la temperatura de +4șC si se resuspendă celulele granulate rămase în 10-20 ml de tampon de distrugere a celulelor.

9. Se agită cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete si se clarifică, se stochează supernatantul în fiecare stadiu, în total de 3 ori.

10. Se adună supernatantii si se centrifughează la 24.000 rpm timp de 120 de minute, la temperatura de +4șC peste un strat de 5 ml de 40% sucroză w/v în PBS, folosindu-se 30 ml tuburi de centrifugare Beckmann si un rotor SW 28.

11. Se înlătură supernatantul, se drenează tuburile si se resuspendă celulele granulate în PBS prin ultrasonare. Se stochează antigenul în alicote la temperatura de -70șC.

1.9. Titrarea antigenului BTV ELISA:

Antigenul BTV ELISA este titrat prin ELISA indirect.

Două dilutii de antigen sunt titrate cu ajutorul unei dilutii constante (1/50) de anticorpi monoclonali 3-17-A3.

Protocolul este următorul:

1.10. Procedura:

1. Se diluează antigen de BTV în PBS peste placa de microtitru într-o serie de două dilutii 50 ”l/godeu cu ajutorul unei pipete cu multiple canale.

2. Se incubează timp de o oră la temperatura de 37șC într-un agitator orbital.

3. Se spală plăcile de 3 ori cu PBS.

4. Se adaugă 50 ”l de anticorp monoclonal 3-17-A3 diluat 1/50 în fiecare godeu al plăcii de microtitru.

5. Se incubează timp de o oră la temperatura de 37șC într-un agitator orbital.

6. Se spală plăcile de 3 ori cu PBS.

7. Se adaugă 50 ”l de globulină de iepure antisoarece conjugată cu peroxidază din hrean, diluată la o concentratie optimă pretitrată, în fiecare godeu al plăcii de microtitru.

8. Se incubează timp de o oră la temperatura de 37șC într-un agitator orbital.

9. Se adaugă substrat si cromogen ca mai sus. Se împiedică reactia după 10 minute prin adăugarea unui mol de acid sulfuric 50 ”l/godeu.

1.11. În încercarea concurentă anticorpul monoclonal trebuie să fie în exces, de aceea se alege o solutie de antigen care se găseste pe curba de titrare ‘nu în zona plăcii”, care dă circa 0,8 OD după 10 minute.

2. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform următorului protocol:

2.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat în orice sistem de cultură celulară care suportă rapida multiplicare a serotipului specific de virus BTV. Sunt recomandate celulele BHK si Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul cresterii virusului, dar trebuie concentrat de 50-100 de ori pentru a fi eficace. Acest lucru se poate realiza prin orice procedură standard de concentrare proteică; virusul din antigen poate fi inactivat prin adăugarea a 0,3% v/v betapropiolactonă.

2.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizându-se un ser de referintă international si un antigen, este produs un ser national standard, standardizat la proportii optime în raport cu serul international de referintă, liofilizat si folosit ca ser de control cunoscut în fiecare test.

2.3. Ser de testare

2.4. Procedura:

a) 1% agaroză preparată în tampon de borat sau barbitol de sodiu, pH 8,5-9,0, este turnată într-o placă Petri la o adâncime minimă de 3,0 mm.

b) Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezeală, fiecare cu diametrul de 5,0 mm, este tăiat în agar. Ansamblul constă într-un godeu central si 6 godeuri dispuse într-un cerc cu raza de 3 mm.

 

1

 

6

 

2

 

X

 

5

 

3

 

4

 

 

c) Se umple godeul central cu antigen standard.

Godeurile periferice 2, 4 si 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt umplute cu ser de testat.

d) Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambiantă într-o cameră închisă, umedă.

2.5. Interpretare: un ser de testare este pozitiv dacă formează o linie de precipitină specifică cu antigenul, precum si o linie completă de identificare cu serul de control. Un ser de testare este negativ dacă nu formează o linie specifică cu antigenul si nu curbează linia serului de control.

Plăcile Petri trebuie examinate pe un fond întunecat si folosind o lumină indirectă.

E. Boala epizootică hemoragică

1. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform următorului protocol:

1.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat în orice sistem de cultură celulară compatibil cu rapida multiplicare a serotipului specific virusului bolii epizootice hemoragice.

Sunt recomandate celulele BHK si Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul cresterii virusului, dar trebuie concentrat de 50-100 de ori pentru a fi eficient. Acest lucru se poate realiza prin orice procedură standard de concentrare proteică; virusul din antigen poate fi inactivat prin adăugarea a 0,3% v/v betapropiolactonă.

1.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizându-se serul international de referintă si un antigen, este produs un ser national standard, standardizat pentru a obtine o proportie optimă în raport cu serul de referintă international, liofilizat si folosit ca ser de control cunoscut în fiecare test.

Serul de testat

1.3. Procedura: 1% agaroză preparată în tampon de borat sau barbitol de sodiu, pH 8,5-9,0, este turnată într-o placă Petri la o adâncime minimă de 3,0 mm.

1.4. Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezeală, fiecare cu diametrul de 5,0 mm, este tăiat în agar. Ansamblul constă într-un godeu central si 6 godeuri dispuse într-un cerc cu raza de 3 mm, de exemplu:

 

1

 

6

 

2

 

X

 

5

 

3

 

4

 

1.5. Godeul central este umplut cu antigen standard.

Godeurile periferice 2, 4 si 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt umplute cu ser de testare.

1.6. Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambiantă într-o încăpere închisă, umedă.

1.7. Interpretare: un ser de testare este pozitiv dacă formează o linie de precipitină specifică cu antigenul, precum si o linie completă de identificare cu serul de control. Un ser de testare este negativ dacă nu formează o linie specifică cu antigenul si nu curbează linia serului de control.

Plăcile Petri trebuie examinate pe un fond întunecat si folosind o lumină indirectă.

F. Leptospiroză

1. Testul de aglutinare microscopică va fi efectuat conform următorului protocol:

1.1. Culturi: trebuie păstrate în mediile Korthof’s sau EMJH la temperatura de 30șC.

1.2. Antigen: contine 2 x 108 organisme/ml din mediul de cultură.

1.3. Procedură: cantităti egale de antigen si ser sunt amestecate în plăci de microtitru cu fund plat si sunt incubate la temperatura de 30șC timp de două ore sau la temperatura de 37șC timp de 1-1 1/2 h. Testul este citit într-o lumină slabă, pe fond întunecat, folosind o magnitudine între 60x si 100x.

1.4. Interpretare: rezultatul este negativ dacă aglutinarea este mai mică de 50% la o dilutie de 1/50.

G. Rinotraheita bovină infectioasă/vulvovaginita pustulară infectioasă

1. Testul de neutralizare a serului se va efectua conform următorului protocol:

1.1. Ser: toate serurile sunt inactivate la temperatura de 56șC timp de 30 de minute înainte de folosire.

1.2. Procedură: pentru testul de seroneutralizare constantă a diferitelor tipuri de virusuri, realizat pe plăci de microtitru, se folosesc celulele MDBK sau alte celule corespunzătoare. Tulpinile Colorado, Oxford sau orice altă tulpină de virus de referintă sunt folosite la 100 TCID50 la 0,025 ml; probe de ser nediluat inactivat sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie de virus.

Amestecurile de ser/virus sunt incubate timp de 2 ore la temperatura de 37șC în plăcile de microtitru, înainte ca celulele MDBK să fie adăugate. Celulele sunt folosite la o concentratie care formează o monocultură completă după 24 de ore.

1.3. Controale:

a) infectiozitatea virusului;

b) toxicitatea serului;

c) culturi celulare care nu au fost inoculate;

d) antiseruri de referintă.

1.4. Interpretare: rezultatele testului de neutralizare si titrul virusului folosit la testare sunt înregistrate după 3-6 zile de incubare la temperatura de 37șC. Titrurile serului sunt considerate negative dacă nu există nici o neutralizare la o dilutie de 1/2 (ser nediluat).

H. Diaree virală bovină (BVD)

1. Testul de izolare a virusului va fi efectuat conform următorului protocol:

a) Materialul de testare si metodele de detectare: se folosesc suspensii de ser, portiuni retractile de coagul sau coaguli de sânge colectate de la probe de sânge proaspăt, care nu au fost inactivate la cald, prelevate de la animale domestice de mai mult de 6 luni. Se foloseste o procedură de colorare imunologică, precum tehnica anticorpului fluorescent (FA) sau ELISA, de exemplu imunoperoxidază

(IPX), pentru a detecta virusul BVD în culturile inoculate.

b) Reactivii de testare: pentru testul FA se cere antiser specific de BVD conjugat cu FITC. Pentru testul IPX se cere ser anti-BVD specific, neconjugat, de origine bovină, antiser antibovin conjugat cu peroxidază si substrat enzimatic corespunzător (de exemplu: 3-amino-9-etilcarbazol).

Se poate folosi ser anti-BVD recoltat de la alte specii decât bovine, cu conditia ca conjugatul de peroxidază să fie dirijat împotriva globulinelor serice ale speciei respective. Toate serurile antivirale folosite trebuie să aibă o specificitate dovedită si să prezinte o reactivitate mare.

c) Procedura: testul foloseste celule susceptibile ca celule turbinate bovine, rinichi de vitel sau testicul de vitel fără virus BVD endogen. Probe de ser: serul de testare si celulele de cultură tisulară sunt plasate în culturi în tuburi acoperite cu dop, în godeuri de plăci de microtitru sau alte containere, astfel încât dilutia finală să fie 10%.

d) Învelisul inflamator si cheagurile de sânge: probele sunt adăugate la culturi celulare monostratificate, confluente si lăsate timp de o oră la temperatura de 37șC, apoi culturile sunt spălate si acoperite de mediu de cultură ce contine 10% ser de fetus de vitel, indemn de BVD.

Culturile sunt incubate ulterior la temperatura de 37șC, fixate si colorate prin metodele FA sau IPX.

e) Controale:

e) 1. control pozitiv al virusului BVD;

e) 2. control negativ fără adaos de virus.

f) Interpretare: testul FA este colorat după 4-6 zile de incubare si citit cu ajutorul razelor ultraviolete. Fluorescenta celulelor incubate cu probele de testat este interpretată ca rezultat pozitiv. Testul IPX este colorat după 4 zile de incubare si citit la lumină microscopică. Culoarea maro închis apărută în citoplasma anumitor celule este interpretată ca rezultat pozitiv.

2. Testul de seroneutralizare serologică va fi efectuat conform următorului protocol:

a) Ser: toate serurile sunt inactivate la cald, la temperatura de 56șC, timp de 30 de minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de neutralizare constantă a diferitelor tipuri de virus pe plăci de microtitru foloseste cellule bovine corespunzătoare, multiplicate în serii (celule bovine turbinate, descrise de Mcclurkin si altii, 1974, Arch. ges. Virusforch., p. 45, 285-289).

c) Este esential ca toti reactivii si celulele să fie indemne de virusul BVD/MD necitopatic, accidental contaminante.

d) Virusul de testare, care poate fi orice tulpină corespunzătoare de referintă citopatică (de exemplu: tulpina NADL), este folosit la o concentratie de 100 doze infectioase de cultură celulară medie la 0,025 ml. Dilutii de seruri inactivate sunt amestecate cu volume egale de suspensie virală (0,025 ml) si amestecurile de ser-virus sunt incubate timp de o oră la temperatura de 37ș înainte de a fi adăugate volume similare de suspensie celulară. Celulele sunt folosite la o concentratie care va forma un monostrat complet după două zile.

e) Controale:

1. controlul infectiozitătii virusului;

2. controlul toxicitătii serului;

3. controlul culturii celulare neinoculate;

4. antiseruri de referintă.

f) Interpretare: cu virusul tulpinii NADL timpul optim pentru citire este după o incubare de 5 zile la temperatura de 37șC.

g) Un titru de neutralizare mediu de 1/10 este considerat indicator al unei reactii imunitare la o infectie anterioară acută.

I. Depistarea mamitelor

Analiza laptelui va fi realizată conform legislatiei în vigoare.

J. Febra aftoasă

1. Colectarea probelor de esofag/faringe si testarea lor se vor efectua conform următorului protocol:

a) Reactivi: înainte de prelevare este preparat mediul de transport. Se distribuie un volum de 2 ml într-un număr de containere egal cu numărul de animale care vor fi testate.

Containerele trebuie să reziste la congelare cu CO2 solid sau azot lichid. Probele se obtin cu ajutorul unui aparat de recoltat saliva sau prin tehnica “probang”. Pentru a obtine o probă se plasează sonda în gură sub limbă si în partea superioară a esofagului. Se încearcă frecarea/raclarea suprafetei epiteliului din partea superioară a esofagului si faringelui prin miscări laterale si dorsale. Dispozitivul probang este retras, de preferintă, după ce animalul a înghitit.

Sonda trebuie să fie plină si să contină un amestec de mucus, salivă, fluid esofagian si fragmente celulare. Se vor lua măsuri ca fiecare specimen să contină material celular vizibil. Se vor evita miscările bruste, care pot provoca sângerări.

Probele prelevate de la anumite animale pot fi puternic contaminate cu continut ruminal. În acest caz probele sunt îndepărtate si se spală gura animalului cu apă sau cu lichid fiziologic înainte de repetarea operatiei.

b) Tratarea probelor: se examinează calitatea fiecărei probe colectate în dispozitivul probang si se adaugă 2 ml într-un volum egal cu mediul de transport într-un container rezistent la congelare. Containerele sunt închise ermetic, sigilate, dezinfectate si etichetate. Probele sunt tinute la rece la temperatura de +4șC si examinate după 3-4 ore sau plasate în gheată uscată la temperatura de -69șC sau în azot lichid si păstrate în stare congelată până la exami- nare. Între două prelevări se spală si se clăteste dispozitivul probang de 3 ori cu apă curată.

c) Testarea virusului FMD: probele sunt inoculate în culturi de celule primare bovine tiroidiene, folosindu-se cel putin 3 tuburi la o prelevare. Pot fi folosite alte celule asemănătoare, precum celule primare de rinichi de bovine sau porcine, dar trebuie retinut că aceste celule sunt mai putin sensibile la anumite tulpini de FMDV. Tuburile sunt inoculate la temperatura de 37șC într-un aparat de rulare si sunt examinate zilnic timp de 48 de ore pentru detectarea prezentei efectului citopatic (CPE). Dacă sunt negative, culturile sunt plasate în alte culturi si reexaminate timp de 48 de ore. Se va confirma specificitatea tuturor CPE.

d) Mijloace de transport recomandate:

1. tampon fosfat de 0,08 M, pH 7,2, continând 0,01% albumină de ser bovin, 0,002% rosu de fenol si antibiotice;

2. mediu de cultură tisulară (Eagle’s MEM) continând tampon Hepes de 0,04 M, 0,01% albumină de ser bovin si antibiotice, pH 7,2.

e) La mediul de transport trebuie adăugate antibioticele (la ml final):

1. penicilină 1.000 u.i.;

2. sulfat de neomicină 100 u.i.;

3. sulfat de polimixină B 50 u.i.;

4. micostatin 100 u.i.

2. Testul de seroneutralizare a virusului trebuie efectuat conform următorului protocol:

a) Reactivi: se prepară antigenul FMDV de stoc în culturi celulare sau pe limbă de bovină si se păstrează la temperatura de 70șC, mai mică sau la temperatura de -20șC după adăugarea a 50% glicerol. Acesta constituie antigenul stoc. În aceste conditii FMDV este stabil si titrurile variază foarte putin pe o perioadă de câteva luni.

b) Procedura: testul este realizat pe plăci de microtitru cu fund plat, prevăzute pentru culturi celulare, folosind celule sensibile ca IB-RS-2, BHK-21 sau celule de rinichi de vitel.

Serurile de testat sunt diluate 1/4 într-un mediu de culturi celulare fără ser, la care se adaugă 100 u.i./ml neomicină sau alte antibiotice adecvate. Serurile sunt inactivate la temperatura de 56șC timp de 30 de minute si se folosesc volume de 0,05 ml pentru prepararea unor serii duble pe plăci de microtitru utilizând 0,05 ml verigi diluante. Se adaugă apoi în fiecare godeu virus pretitrat, diluat în mediu de cultură fără ser, continând 100 TCID50/0,05 ml. După incubare la temperatura de 37șC timp de o oră pentru a permite reactia de neutralizare se adaugă în fiecare godeu 0,05 ml de suspensie celulară ce contine 0,5-1,0 x 106 celule la ml într-un mediu de cultură celulară continând ser fără anticorpi la FMD, după care plăcile sunt sigilate.

Plăcile sunt incubate la temperatura de 37șC. Monoculturile devin normal confluente în 24 de ore. CPE este în mod normal suficient de dezvoltat la 48 de ore pentru a permite o citire microscopică a testului. În acest moment se poate efectua o citire microscopică finală sau plăcile pot fi fixate si colorate în vederea unei citiri macroscopice, utilizându-se, de exemplu, 10% formol si 0,05% albastru de metilen.

c) Controale: controalele fiecărui test cuprind antiserul corespunzător al titrului cunoscut, controlul celulelor, controlul toxicitătii serului, controlul mediului si titrul virusului de la care se calculează cantitatea reală a virusului continută în test.

d) Interpretare: godeurile care prezintă CPE sunt considerate infectate si titrurile de neutralizare sunt exprimate ca reprezentând reciproca dilutiei finale de ser prezent în amestecurile de ser-virus la punctul final de 50% estimat după metoda Spearman-Karber.

e) Testele sunt considerate valide dacă cantitatea reală de virus folosită la godeu este cuprinsă între 101,5 si 102,5 TCID50 si dacă titrul serului de referintă se găseste într-o zonă dublă a titrului anticipat, estimat după modul de realizare a titrărilor precedente. Când martorii se găsesc în afara acestor limite se repetă probele. Un titru final de 1/11 sau inferior este considerat negativ.

3. Detectarea si cuantificarea anticorpului prin testul ELISA se va efectua conform următorului protocol:

a) Reactivi: antiseruri de iepure împotriva antigenului 146S de 7 tipuri de virus ai febrei aftoase (FMDV) folosite la o concentratie optimă predeterminată într-un tampon de carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se prepară antigeni din tulpinile de virus selectate, cultivate pe celule monocelulare BHK-21. Se utilizează supernatanti nepurificati, pretitrati conform protocolului, dar fără ser pentru a da o dilutie, care după adăugarea unui volum egal de PBST (lichid fiziologic tamponat cu fosfat, continând 0,05% Tween-20 si indicator rosu fenol) ar da o intensitate optică între 1,2 si 1,5. Virusurile pot fi folosite inactivate. PBST este folosit ca diluant. Se prepară serurile de cobai prin inocularea cobailor cu antigen 146S din fiecare serotip. Se prepară o concentratie optimă predeterminată în PBST, ce contine 10% ser normal de bovină si 5% ser normal de iepure. Se foloseste imunoglobulină de iepure anticobai conjugată cu peroxidază din hrean la o concentratie optimă predeterminată în PBST, ce contine 10% ser normal de bovină si 5% ser normal de iepure. Serurile de testat sunt diluate în PBST.

b) Procedura:

1. Plăcile ELISA sunt acoperite cu 59 u.i. seruri antivirale de iepure si lăsate peste noapte într-o incintă umedă, la temperatura ambiantă.

2. Se prepară 50 ”l de duplicat, serii duble din fiecare ser de testat începând cu 1/4 în plăci cu multe godeuri si cu fundul în formă de U (plăci purtătoare). Se adaugă în fiecare godeu 50 ”l dintr-o doză constantă de antigen si se lasă amestecurile peste noapte la temperatura de 4șC.

Adăugarea antigenului reduce dilutia serică initială la 1/8.

3. Se spală plăcile ELISA cu PBST de 5 ori.

4. Se transferă apoi 50 ”l din amestecurile ser-antigen din plăcile purtătoare în plăcile ELISA acoperite cu ser de iepure si se incubează la temperatura de 37șC timp de o oră pe un agitator rotativ.

5. După spălare se adaugă în fiecare godeu 50 u.i. de antiser de cobai la antigenul folosit la lit. d). Se incubează plăcile la temperatura de 37șC timp de o oră pe un agitator rotativ.

6. Se spală plăcile si se adaugă în fiecare godeu 50 ”l de imunoglobulină de iepure anticobai, conjugată cu peroxidază din hrean. Plăcile sunt incubate la temperatura de 37șC timp de o oră pe un agitator rotativ.

7. Se spală plăcile si se adaugă în fiecare godeu 50 u.i. de ortofenilen diamină, ce contine 0,05% H2O2 30% p/v.

8. După 15 minute se opreste reactia cu H2SO4 de 1,25 M. Se efectuează citirea spectrofotometrică a plăcilor la 492 nm cu ajutorul unui cititor ELISA, cuplat la un microordinator.

c) Controale: pentru fiecare antigen utilizat 40 de godeuri nu contin ser, ci antigen diluat într-un PBST:

1. o serie dublă de două dilutii de antiser bovin omolog de referintă;

2. o serie dublă de două dilutii de ser bovin negativ.

d) Interpretare: titrurile anticorpilor sunt exprimate ca reprezentând dilutia finală a serurilor de testat, dând 50% din valoarea medie OD înregistrată în godeurile de control al virusului în absenta serului de testat. Titrurile superioare valorii de 1/40 sunt considerate pozitive.

 

CAPITOLUL III

Porcine

 

A. Tuberculoză

Testul tuberculinic intradermic, care utilizează tuberculina aviară, trebuie efectuat în conformitate cu procedurile din cap. II lit. A pct. 1, cu exceptia faptului că locul injectiei va fi pielea fină de la baza urechii.

B. Bruceloză

Testul de seroaglutinare si de fixare a complementului va fi efectuat în conformitate cu cap. II lit. B pct. 1 si 2.

C. Boala lui Aujeszky

Testul de seroneutralizare se va efectua în conformitate cu următorul protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încălzire la temperatura de 56șC timp de 30 de minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant pe diferite plăci de microtitru foloseste sisteme celulare Vero sau alte sisteme celulare senzitive. Virusul bolii lui Aujeszky este utilizat la 100 TCID50 per 0,025 ml; probele de seruri inactivate, nediluate, sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie de virus. Amestecul virus-ser este incubat timp de două ore la temperatura de 37șC în plăci de microtitru înainte de adăugarea celulelor potrivite. Celulele sunt utilizate într-o concentratie, care formează după 24 de ore un monostrat complet.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitătii virusului;

2. controlul toxicitătii serului;

3. controlul culturilor celulare neinoculate;

4. referinta antiserului.

d) Interpretare: rezultatele testului de neutralizare si titrul virusului utilizat în test se înregistrează după 3-7 zile de incubare la temperatura de 37șC. Dacă titrul serului este mai putin de jumătate (material seminal nediluat) testul este considerat negativ.

D. Gastroenterita transmisibilă (TGE)

Testul de seroneutralizare va fi efectuat în conformitate cu următorul protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încălzire la temperatura de 56șC timp de 30 de minute înaintea utilizării.

b) Procedura: testul de seroneutralizare pe plăci de microtitru foloseste celule A72 (tumori de câine) sau alte sisteme celulare sensibile. Virusul TGE se foloseste la 100 TCID50 per 0,025 ml; probele de ser inactivate, nediluate, sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie virală. Amestecul virus-ser este incubat 30-60 minute la temperatura de 37șC în plăcile de microtitru înainte de a se adăuga celulele potrivite. Celulele sunt utilizate într-o concentratie, care după 24 de ore formează un monostrat complet. Fiecare celulă primeste 0,1 ml de suspensie celulară.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitătii virusului;

2. controlul toxicitătii serului;

3. controlul celulelor neinoculate;

4. referinte antiser.

d) Interpretare: rezultatele testului de seroneutralizare si titrul virusului utilizat în test sunt înregistrate după o incubare de 3-5 zile la temperatura de 37șC. Dacă titrul serului este mai putin de jumătate (dilutie finală), testul este considerat negativ. Dacă probele de ser nediluat sunt toxice pentru tesuturile de cultură, aceste seruri pot fi diluate 1/2 înainte de a fi utilizate în test. Acesta corespunde unei dilutii finale a serului de 1/4. La titrul serului mai putin de 1/4 (dilutie finală) testul este considerat negativ.

E. Influenta suină

Testul de inhibare a hemaglutinării se va efectua conform următorului protocol:

a) Procedura: testul se realizează prin metode standard pentru distrugerea inhibitorilor nespecifici; serurile suine ar trebui tratate fie cu o enzimă care distruge receptorii (filtrat de Vibrio Cholerae), incubată peste noapte la temperatura de 37șC, acest tratament fiind urmat de o reîncălzire la temperatura de 37șC timp de 30 de minute pentru distrugerea întregii activităti reziduale enzimatice, fie cu 25% kaolină, păstrată pe durata noptii la temperatura de 4șC.

După absorbtia cu o suspensie de eritrocite de pasăre 10% incubată timp de o oră la temperatura de 37șC, serurile sunt testate cu ajutorul a 4 unităti hemaglutinante ale virusului respectiv, utilizându-se eritrocite de pasăre 1%.

Virusul si serul se lasă în contact timp de 60 de minute la temperatura camerei înainte de adăugarea eritrocitelor.

b) Interpretare: titrurile de 1/10 sau mai mari sunt considerate pozitive.

F. Febra aftoasă

Testele pentru febra aftoasă la porcine se vor efectua conform protocoalelor stabilite în cap. II lit. J.

G. Boala veziculoasă a porcului

Testul de seroneutralizare se va efectua conform următorului protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încălzire la temperatura de 56șC timp de 30 minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant variabil pe plăci de microtitru foloseste celule IB-RS-2 sau alte sisteme celulare senzitive G27/72 sau orice alt tip de tulpină utilizată la 100 TCID50 per 0,025 ml. Serurile testate sunt diluate 1/4 si inactivate, apoi se prepară două serii de dilutii. Probele de ser sunt amestecate cu un volum egal de suspensie virală si incubate timp de o oră la temperatura de 37șC în plăcile de microtitru înainte de adăugarea a 0,025 ml suspensie celulară continând 3 x 106 celule/ml.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitătii virusului;

2. controlul toxicitătii serului;

3. controlul celulelor neinoculate;

4. referinta antiserurilor.

d) Interpretare: rezultatul testului si titrul virusului utilizat în test sunt înregistrate după 3-5 zile de incubare la temperatura de 37șC. Titrul serului este considerat negativ dacă nu există neutralizare la dilutia 1/11.

H. Pesta porcină clasică (PPC)

Recoltarea materialelor pentru diagnostic

1. Pentru izolarea virusului si detectarea antigenilor sunt considerate importante portiuni de tesut din splină si amigdale. Este de dorit să se recolteze încă cel putin alte două tesuturi limfatice (cum ar fi: limfonodulii retrofaringieni, paratiroidieni, mandibulari sau mezenterici) alături de ileon sau rinichi. Fiecare probă de tesut va fi pusă într-o pungă de plastic separată, sigilată si etichetată. Probele vor fi transportate si depozitate în containere etanse. Probele nu vor fi congelate, dar vor fi tinute la temperatura de refrigerare si supuse testării fără întârziere.

2. Probele de sânge pentru izolarea virusului din leucocite se vor recolta de la porci care au febră sau care prezintă alte semne de boală. Ca anticoagulant se va folosi EDTA sau heparina. Probele se păstrează la temperatura de refrigerare si se trimit la laborator fără întârziere pentru efectuarea testelor.

3. Probele de sânge pentru detectarea anticorpilor ca un ajutor pentru diagnosticul clinic în focar sau pentru supravegherea efectivelor vor fi recoltate de la animale care s-au însănătosit după ce au trecut prin infectii suspecte sau de la porci cunoscuti că au avut contact cu animale infectate sau suspecte. În fiecare exploatatie suspectă tuturor animalelor dintre primele 20 suspecte de boală sau suspecte că au avut contact cu animale bolnave si la 25% din restul animalelor li se vor recolta probe de sânge. În ideea asigurării unei foarte mari probabilităti de detectare a anticorpilor probele vor fi recoltate din fiecare unitate a exploatatiei.

Diagnosticul de laborator al PPC

1. Bazele diagnosticului de laborator al PPC constau în evidentierea antigenilor virali, a virusului sau a anticorpilor prezenti în organe ori fluide tisulare.

2. În cazul unor rezultate neconcludente testele vor fi repetate pe aceleasi probe. Dacă suspiciunile clinice continuă, se vor recolta probe suplimentare din aceleasi surse.

3. Testele serologice pentru evidentierea anticorpilor pot fi folosite ca un criteriu secundar de diagnostic al cazurilor suspecte de PPC. Dacă evidentierea antigenilor virali sau izolarea virusului nu s-a putut realiza pe materialele provenite de la animale care au dat nastere suspiciunii de PPC sau cu materiale din exploatatii care au avut contact cu cazuri de PPC, testele pentru evidentierea anticorpilor se vor efectua pe probe de sânge de la animale care nu mai sunt suspecte si de la animale suspecte de a fi avut contact cu boala.

Evidentierea antigenului viral

1. Pentru evidentierea antigenului viral din portiuni de tesut din organe din tesuturi imunocompetente trebuie să fie utilizată tehnica prin care se obtin sectiuni subtiri la criostat de până la 5 microni, din tonsile sau din alte organe mentionate la titlul “Recoltarea materialelor pentru diagnostic”.

Reagentul de diagnostic trebuie să fie un antiser policlonal specific - pestivirus - pentru virusul PPC, marcat cu fluorocrom (marcaj luminiscent), cu o enzimă sau cu biotină, în conformitate cu următoarele criterii:

a) serul hiperimun va fi preparat de la porci care sunt liberi de infectii, iar serul lor nu contine nici un fel de anticorpi care ar putea afecta specificitatea sau calitatea reactiilor;

b) imunoglobulinele marcate, preparate din ser hiperimun PPC de porc, după cum se mentionează la lit. a), vor avea un titru minim de lucru de 1/20, determinat pe culturi celulare infectate cu virusul PPC si confirmat prin teste de verificare pe sectiuni de tesut. Dilutia de lucru a conjugatului trebuie să combine maximum de semnal cu minimum de colorare a fondului.

2. Orice probă care indică o reactie citoplasmatică specifică va fi considerată pozitivă pentru pestivirus. În asemenea cazuri testele ulterioare trebuie efectuate conform descrierii de la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri”.

Izolarea virusului si identificarea în culturi celulare 1. Izolarea virusului din probe de tesut se face pe culturi celulare sensibile PK 15 sau pe alte linii celulare la fel de sensibile (susceptibile). Suspensia din organul provenit de la animalul suspect se va inocula la dilutia de 1/10.

2. Izolarea virusului din probe de sânge, recoltat si manipulat după cum este indicat la titlul “Recoltarea materialelor pentru diagnostic”, se realizează prin inocularea culturilor celulare cu o suspensie de globule albe, reconstituită până la volumul original de sânge.

3. Pentru detectarea antigenului viral în citoplasma inoculatelor aceste culturi celulare trebuie tratate cu un antiser policlonal marcat. Colorarea trebuie să se realizeze la intervale de 24 si 72 de ore din momentul inoculării.

4. Culturile pozitive trebuie să facă obiectul testelor de diagnostic diferential, după cum se specifică la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri”. Rezultatele negative după primul pasaj pe culturi celulare determină efectuarea unui al doilea pasaj sau chiar a mai multor pasaje pentru izolarea virusului.

Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali

1. Duplicatele sectiunilor tisulare criostatice sau ale culturilor celulare care prezintă reactii pozitive cu serul policlonal antivirus descris la titlurile “Evidentierea antigenului viral” si “Izolarea virusurilor si identificarea în culturi celulare” vor fi examinate din nou cu ajutorul anticorpilor monoclonali marcati, pentru a diferentia virusul PPC de virusul diareei virale bovine sau al bolii mucoaselor (BVD/MD).

2. Trebuie să se utilizeze numai anticorpii monoclonali recomandati oficial de către laboratorul comunitar de referintă pentru pesta porcină clasică.

3. Anticorpii monoclonali trebuie să fie grupati în 4 liste, conform următoarelor criterii:

Numărul grupei Reactivitate

1........................ Toate virusurile pestoase

2........................ Toate virusurile PPC

3........................ Suse ale vaccinului contra PPC

4........................ Toate virusurile BVD/MD

Fiecare listă poate fi reprezentată fie printr-un singur anticorp monoclonal, fie de un melanj de anticorpi monoclonali, astfel încât spectrul de reactivitate să corespundă celui indicat anterior.

4. Interpretarea profilului reactiei poate fi rezumată astfel:

 

Tabel

Interpretare

1 2 3 4

 

+ + - -

PPC confirmat

+ + + -

PPC tulpină vaccinală

+ - - +

Virus BVB/MD

 

Detectarea anticorpilor antivirali ai pestei porcine clasice

1. Detectarea anticorpilor antivirali PPC în esantioanele de sânge se efectuează pentru a veni în sprijinul diagnosticării pestei porcine în unităti cu porci care prezintă semne clinice de boală sau pentru a decela boala la porcii recunoscuti a fi avut contacte cu porci infectati. Această probă poate fi efectuată în egală măsură la sfârsitul perioadei de supraveghere sau pentru a controla efectivele al căror statut este necunoscut.

2. Pentru aceasta, probele de sânge trebuie să fie supuse unui test aprobat. Următoarele teste sunt aprobate pentru utilizare si trebuie să comporte includerea serurilor de control pozitive si negative. Susele de virus de utilizat pentru testele serologice trebuie să fie agreate de laboratorul de referintă comunitară pentru pesta porcină clasică.

Testul de neutralizare a virusului

1. Acest test se bazează pe determinarea titrului neutralizant 50% final. Se inoculează culturile cu un amestec din serul diluat si o cantitate constantă de virus după o perioadă specifică de incubare la temperatura de 37șC.

Rezultatele se bazează pe absenta unei replicări virale detectabile printr-un sistem de anticorpi marcati. Se poate utiliza fie testul de neutralizare - imunofluorescentă, fie de neutralizare - imunoperoxidază.

2. În scopul detectării se vor dilua initial serurile 1/10.

Dacă este necesară o titrare completă, se prepară dilutii ale serului în baza doi începând cu dilutia 1/10. Fiecare dilutie se amestecă cu un volum egal de suspensie de virus care contine 100 .10,5 10 g 10 doze infectante” “TCID50”. Se utilizează pentru fiecare dilutie cel putin două culturi. După o perioadă corespunzătoare de incubare culturile celulare se fixează si antigenul viral se poate detecta printr-un procedeu de colorare cu ajutorul anticorpilor marcati. Rezultatele se exprimă prin reciproca dilutiei initiale a serului pentru care jumătate din culturile de cellule inoculate nu prezintă coloratie specifică. Se estimează titrul la zona dintre două dilutii.

Metoda imunoenzimatică (ELISA)

1. Se pot utiliza pe orice suport adecvat tehnici competitive, prin blocaj sau indirecte, pentru ca testele utilizate să reducă la minimum reactiile încrucisate cu virusul diareei virale bovine si cu alte pestivirusuri. Totusi sistemul de testare trebuie să garanteze identificarea tuturor infectiilor datorate PPC si a tuturor stadiilor răspunsului imunitar fată de infectie.

2. Antigenul trebuie să provină din proteine virale ale unuia dintre susele recomandate de virus al PPC sau care să îi corespundă. Celulele utilizate la prepararea antigenului trebuie să fie indemne fată de orice infectie indusă de pestivirusuri.

3. Antiserurile policlonale pentru probele prin competitie sau prin blocare trebuie să se producă pe porci sau iepuri infectati cu una dintre susele recomandate ale virusului PPC sau prin susa C lapinizată. Anticorpii monoclonali trebuie să fie dirijati contra unei proteine virale imunodominante a virusului PPC sau să îi corespundă acesteia.

4. Testele indirecte trebuie să utilizeze un ser antiimunoglubuline de porc care să detecteze IgG si IgM.

5. Sensibilitatea testului ELISA trebuie să fie suficient de ridicată pentru a da o reactie pozitivă cu toate serurile active în testul de neutralizare, precum si cu serurile pozitive de referintă furnizate de laboratorul comunitar de referintă pentru PPC.

6. Metoda ELISA nu poate fi utilizată decât cu probe de ser sau plasmă care să provină de la porci individuali.

7. Dacă metoda ELISA nu este specifică PPC, probele pozitive trebuie să facă obiectul testelor diferentiale suplimentare, asa cum sunt descrise la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri”.

Evaluarea rezultatelor testelor de laborator

1. Punerea în evidentă a antigenului virusului PPC în tesuturile organelor sau în culturi celulare după izolarea virusului din esantionul de tesut conform tehnicilor descries la titlurile: “Evidentierea antigenului viral”, “Izolarea virusului si identificarea în culturi celulare” si “Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali” constituie baza confirmării prezentei bolii, în afară de cazul în care se demonstrează că reactia se datorează virusului vaccinal definit în conformitate cu titlul “Tipajul pestivirusurilor isolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali”. Punerea în evidentă a antigenului anti-BVD/MD în conformitate cu titlul “Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali” infirmă suspiciunea de PPC, precum si faptul că suspiciunea nu se bazează pe alte cauze. În cazul unor rezultate neobisnuite sau neasteptate ale tipizării prin anticorpi monoclonali, conform titlului “Tipajul pestivirusurilor isolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali”, componentele de pestivirus izolate trebuie să fie considerate neclasificate, iar efectivul de origine este considerat suspect până la efectuarea altor teste. Virusul se va trimite laboratorului comunitar de referintă în scopul caracterizării si al realizării anchetelor serologice în efectivele de origine.

2. În cazul detectării anticorpilor care reactionează cu virusul PPC efectivul de origine va fi considerat suspect.

a) Pentru a infirma suspiciunea de PPC care poate să apară prin detectarea anticorpilor, testul descris la titlul “Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri” se utilizează pentru a stabili o distinctie între anticorpii care reactionează la PPC, susceptibili de a fi indusi de alte pestivirusuri, si anticorpii virusului PPC, indusi chiar de acesta. Toate probele originale trebuie să facă obiectul unui test diferential.

b) Dacă suspiciunea nu poate fi exclusă cu ocazia primului test diferential, trebuie efectuat un alt test cu cel putin 30 de zile mai târziu, pentru a detecta o posibilă propagare a infectiei. Se vor ridica probe de la primele 20 de animale din ferma suspectă si de la 25% dintre animalele rămase în efectiv.

Interpretarea rezultatelor serologice

1. Un titru de neutralizare a virusului superior sau egal cu 1/10 la oricare dintre porci, asociat cu un parametru clinic sau epizootologic care să permită să se suspecteze boala, constituie un diagnostic pozitiv. Un titru superior sau egal cu 1/10 la oricare dintre porcii care nu se asociază cu nici un simptom clinic sau epizootologic permite suspectarea bolii si trebuie să fie urmat de un diagnostic diferential.

2. Aceleasi criterii trebuie să fie aplicate oricărui porc care prezintă un rezultat pozitiv la testul ELISA.

Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri

1. Testele pentru diagnosticul diferential între PPC si alte infectii induse de un pestivirus se bazează pe titrări în paralel ale serului, utilizându-se atât suse de virusuri PPC, cât si suse de virusuri BVD/MD si folosindu-se metode strict comparabile.

a) Susele de virusuri PPC si de virusuri BVD/MD folosite au fost anterior aprobate oficial (conform titlului “Detectarea anticorpilor antivirali ai pestei porcine clasice”).

Pentru a exclude orice suspiciune de PPC datorată detectării de anticorpi, esantioanele sanguine vor fi examinate prin titrarea comparativă a anticorpilor virusului PPC si virusurilor BVD/MD.

b) În testul ELISA blocat se poate utiliza compararea dintre procentajele inhibate de către antigenii PPC si BVD/MD.

2. Rezultatele testelor serologice comparative care utilizează suse de referintă de PPC si alte pestivirusuri vor fi interpretate astfel:

a) dacă testele comparative arată că mai mult de un porc prezintă anticorpi ai virusului PPC, dar nici un anticorp contra altor pestivirusuri, rezultatul testului este considerat pozitiv în ceea ce priveste PPC;

b) dacă testele comparative relevă că titrurile în ceea ce priveste PPC sunt egale sau superioare titrurilor altor pestivirusuri la mai mult de un porc, se suspicionează  PPC, iar diferentierea se efectuează astfel:

1. acei porci care prezintă titruri neutralizante în ceea ce priveste virusul PPC superioare sau egale titrurilor neutralizante ale altor pestivirusuri vor fi sacrificati. Tesuturile lor si, dacă este vorba de gestante, fetusii vor fi supusi unei examinări pentru punerea în evidentă a antigenului sau virusului PPC, conform procedurii descrise la titlurile: “Evidentierea antigenului viral”, “Izolarea virusului si identificarea în culturi celulare” si .Tipajul pestivirusurilor isolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali”;

2. dacă se decelează antigenul viral sau virusul PPC, se confirmă PPC;

3. dacă testarea vizată la pct. 2 nu permite revelarea prezentei antigenului virusului PPC, unitatea va fi considerată suspectă, până când o nouă serie de probe sanguine prelevate cu cel putin 30 de zile mai târziu va fi supusă unor noi teste comparative;

4. dacă aceste teste comparative ulterioare arată că toate animalele prezintă titruri neutralizante sensibil mai mari (de 4 ori sau mai mult) contra virusului BVD/MD/BD decât virusul PPC, suspiciunea se infirmă;

5. dacă unul sau mai multe animale prezintă un titru în ceea ce priveste PPC egal sau superior titrului dat de virusul BVD/MD, rezultatul se consideră pozitiv în ceea ce priveste PPC;

c) dacă titrurile în ceea ce priveste BVD/MD se prezintă astfel încât nu putem exclude posibilitatea prezentei PPC, unitatea va fi considerată suspectă si va fi testată din nou după minimum 30 de zile.

Diagnosticul diferential în pesta porcină africană

1. Pesta porcină africană (PPA) nu poate fi diferentiată de pesta porcină clasică prin examene clinice sau postmortem. Aceste maladii trebuie luate în considerare în diagnosticul diferential al oricărui sindrom hemoragic febril acut la porcine. Testele de laborator sunt esentiale pentru a face diferenta dintre cele două maladii. Un diagnostic pozitiv într-o tară indemnă de PPA trebuie să se bazeze pe izolarea si identificarea virusului PPA. Baza principală a diagnosticului de laborator în PPA trebuie să o constituie punerea în evidentă a virusului, antigenului viral sau a anticorpilor în organe si secretiile tisulare. În cazul unor rezultate neconcludente sau negative, pentru mai putin de două teste efectuate pe esantioane din animalele suspecte de PPA sau pe material care să provină din ferme care au fost în contact cu cazuri de PPA, se va preleva material suplimentar din aceeasi unitate si de la animale care au fost în contact cu boala.

2. Evidentierea antigenului viral

Pentru evidentierea antigenului viral, pentru examinarea sectiunilor fine criostatice din tesuturile organelor sau din materialul etalat ori a sedimentelor culturilor leucocitare se utilizează tehnica de imunofluorescentă directă sau alte tehnici asemănătoare. Metodele utilizate sunt similare celor descrise pentru PPC, cu exceptia faptului că se folosesc reactivi specifici pentru PPA.

3. Izolarea si identificarea virusului

a) Testul de hemadsorbtie (HAD)

Testul de hemadsorbtie se efectuează prin inocularea suspensiei tisulare 10% sau a sângelui colectat pe teren de la porcii suspecti în culturi leucocitare primare de porc sau prin prepararea unor culturi leoucocitare din sânge ce provine de la porci febrili, inoculate în laborator sau prelevate pe teren. Hemadsorbtia constă în aglutinarea unui mare număr de eritrocite de porc la suprafata celulelor infectate si confirmă diagnosticul de PPA.

b) Inocularea porcilor

Se obtine un amestec format din picături din suspensii tisulare 10%, din care se inoculează pe cale intramusculară câte 2 ml/porc, la 4 porci, dintre care 2 au fost vaccinati contra pestei porcine clasice si 2 nu au fost vaccinati. În fiecare zi se ia temperatura rectală a animalelor pentru a se constata cresterea acesteia si debutul semnelor clinice, pe o perioadă de 21 de zile. În cazul aparitiei febrei se ridică probe de sânge în vederea preparării culturilor leucocitare destinate testului de hemadsorbtie (“autorosette” si inocularea culturilor leucocitare primare de porc).

Dacă nu apare nici un simptom clinic, se iau probe de sânge în scopul detectării de anticorpi după o perioadă de observatie de 21 de zile.

c) Detectarea anticorpilor indusi de virusul PPA în probele de ser si în secretiile tisulare

Detectarea anticorpilor în probele de ser sau în secretiile tisulare se realizează pentru a contribui la diagnosticarea PPA în crescătoriile cu porci care prezintă simptome clinice care permit suspectarea bolii sau la porcii recunoscuti a fi avut un contact cu porci infectati cu PPA.

Ea se poate efectua în scopul supravegherii sau anchetării în efectivele cu statut necunoscut. Pentru acest scop esantioanele ridicate sunt supuse unui test aprobat. Sunt agreate si trebuie să se efectueze cu seruri-martor positive si negative corespunzătoare următoarele teste:

- testul de imunofluorescentă (IFI);

- ELISA.

I. Leptospiroza

Testele pentru leptospiroză la porcine se vor efectua în conformitate cu cap. II lit. F.

 

ANEXĂ

la norma sanitară veterinară

 

CONDITII MINIME

pentru autorizarea târgurilor de animale, fermelor de carantină sau centrelor de colectare

în cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din tări terte

 

1. Târgurile de animale, fermele de carantină sau centrele de colectare vor fi supravegheate de un medic veterinar oficial.

2. Fiecare târg de animale, fermă de carantină sau centru de colectare va fi situat în centrul unei zone cu diametrul de 20 km, în care, conform constatărilor oficiale, cu cel putin 30 de zile înaintea folosirii lor ca târguri de animale, ferme de carantină sau centre de colectare autorizate nu s-a înregistrat nici un faz de febră aftoasă, iar în cazul celor pentru porcine nu s-a înregistrat nici un caz de pestă porcină, boală veziculoasă a porcului sau encefalomielită enterovirală porcină.

3. Înainte de utilizare ele vor fi curătate si dezinfectate cu un dezinfectant oficial autorizat de tara exportatoare ca eficient în controlul bolilor mentionate la pct. 2.

4. Târgurile de animale, fermele de carantină sau centrele de colectare, în functie de capacitatea de cazare, trebuie să aibă:

a) o amenajare destinată exclusiv acestui scop;

b) spatii si instalatii corespunzătoare pentru încărcarea, descărcarea si cazarea adecvată a animalelor, la un standard corespunzător, pentru adăparea si furajarea lor si pentru a le administra orice tratament necesar; aceste spatii si instalatii trebuie să fie usor de curătat si dezinfectat;

c) utilităti corespunzătoare pentru inspectie;

d) utilităti corespunzătoare pentru izolare;

e) echipament corespunzător pentru curătarea si dezinfectia încăperilor si camioanelor;

f) o zonă corespunzătoare de depozitare pentru furaje, asternut si gunoi de grajd;

g) un sistem corespunzător pentru colectarea apei reziduale;

h) un birou pentru medicul veterinar oficial.

5. Târgurile de animale, fermele de carantină sau centrele de colectare trebuie să fie inspectate periodic pentru a se verifica dacă conditiile pentru autorizare continuă să fie îndeplinite.

6. Proprietarul sau persoana responsabilă de târgul de animale, ferma de carantină sau centrul de colectare trebuie să înscrie într-un registru sau într-o bază de date care va fi păstrată pentru o perioadă de minimum 3 ani următoarele informatii:

a) numele proprietarului, originea, data de intrare si de iesire, numărul de identificare a bovinelor, numărul de înregistrare a exploatatiei de origine sau a efectivului de origine a porcilor care intră în târgul de animale, ferma de carantină sau centrul de colectare si destinatia lor;

b) numărul de înregistrare al transportatorului si numărul de autorizatie al camionului care livrează sau colectează animalele din târgul de animale, ferma de carantină sau centrul de colectare.

7. Punctele de achizitii, spatiile de încărcare sau alte spatii prin care pot trece bovinele ori porcinele destinate exportului vor satisface conditiile prevăzute la pct. 1, 2 si 3.

8. Toate porcinele si bovinele care trec prin târgul de animale, ferma de carantină sau centrul de colectare autorizat trebuie să fie identificate si să îndeplinească conditiile de sănătate stabilite pentru categoria de animale respectivă.

9. Animalele care vor fi exportate si care trec prin târgul de animale, ferma de carantină sau centrul de colectare pot fi exportate după minimum 6 zile de la intrarea în fermă, dacă sunt îndeplinite conditiile sanitare veterinare si se respectă următoarele conditii:

a) să nu vină în contact cu animale biongulate, altele decât bovine sau porcine care îndeplinesc conditiile de sănătate stabilite pentru importul categoriei de animale;

b) să fie separate în transporturi astfel încât nici unul dintre ele să nu contină animale pentru reproductie sau productie si animale pentru tăiere imediată;

c) să fie încărcate în vehicule de transport sau containere care au fost initial dezinfectate cu un dezinfectant autorizat oficial în tara exportatoare, eficient în controlul bolilor mentionate la pct. 2;

d) mijlocul de transport trebuie astfel construit încât să nu fie posibil ca fecalele, urina, paiele sau furajele să curgă sau să cadă din vehicule pe durata transportului.

10. În cazul în care în conditiile pentru export de animale în perioada de carantină se pretinde să se efectueze un test în cadrul perioadei specificate înainte de încărcare, acea perioadă începe o dată cu ziua în care animalele au fost introduse în ferma de carantină.

11. Tara exportatoare va autoriza târgurile de animale, fermele de carantină sau centrele de colectare pentru animale de reproductie si productie, precum si pentru animale destinate tăierii si va notifica Comisiei Europene si autoritătilor centrale competente ale statelor membre ale Uniunii Europene numele si adresa acestora.

12. Tara exportatoare va stabili procedura pentru supraveghere oficială a târgurilor de animale, fermelor de carantină sau centrelor de colectare, a bazelor de achizitie, a spatiilor de încărcare si va asigura efectuarea unei astfel de supravegheri.

13. Tara exportatoare se asigură ca informatiile referitoare la târgurile de animale, fermele de carantină si centrele de colectare să fie incluse în certificatul de sănătate care însoteste animalele exportate.

14. Târgurile de animale, fermele de carantină sau centrele de colectare pentru export de bovine sau porcine din România către statele membre ale Uniunii Europene vor fi autorizate conform legislatiei nationale. După autorizare o copie de pe dosarul de autorizare, inclusiv o copie de pe autorizatie, este înaintată autoritătii veterinare centrale a României.

15. Autoritatea veterinară centrală a României va înscrie târgul de animale, ferma de carantină sau centrul de colectare în lista oficială si va acorda un cod care va fi mentionat obligatoriu în certificatul de sănătate. Ferma de carantină devine operatională din momentul comunicării, respectiv acordării datelor si a codului din lista oficială a autoritătilor veterinare judetene.

16. România va aviza importul de bovine si porcine din tări terte numai dacă acestea detin târguri de animale, ferme de carantină sau centre de colectare aprobate de serviciile veterinare ale tării respective si transmise la Agentia Natională Sanitară Veterinară.

 

MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PĂDURILOR

 

ORDIN

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind conditiile generale de igienă în exploatatiile de animale producătoare de lapte

 

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pădurilor,

în temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitară veterinară nr. 60/1974, republicată, cu modificările si completările ulterioare,

în baza Hotărârii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Pădurilor, cu modificările si completările ulterioare,

văzând Referatul de aprobare nr. 157.971 din 24 iulie 2002, întocmit de Agentia Natională Sanitară Veterinară,

emite următorul ordin:

Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară veterinară privind conditiile generale de igienă în exploatatiile de animale producătoare de lapte, prevăzută în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. - Agentia Natională Sanitară Veterinară, institutele centrale de profil si directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. - Agentia Natională Sanitară Veterinară va controla modul de aplicare a prevederilor prezentului ordin.

Art. 4. - La data intrării în vigoare a prezentului ordin se abrogă orice alte dispozitii contrare.

Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I.

 

Ministrul agriculturii, alimentatiei si pădurilor,

Ilie Sârbu

 

Bucuresti, 1 august 2002.

Nr. 346.

 

ANEXĂ

 

NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ

privind conditiile generale de igienă în exploatatiile de animale producătoare de lapte

 

Art. 1. - Prezenta normă sanitară veterinară stabileste conditiile generale de igienă aplicabile în exploatatiile de animale producătoare de lapte.

Art. 2. - În sensul prezentei norme sanitare veterinare, se întelege prin:

a) exploatatie de animale producătoare de lapte - unitatea în care sunt tinute una sau mai multe vaci, oi, capre sau bivolite producătoare de lapte;

b) autoritate veterinară competentă - autoritatea veterinară centrală, autoritatea veterinară judeteană si a municipiului Bucuresti, reprezentată prin directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti, precum si autoritatea veterinară locală reprezentată prin circumscriptia sanitară veterinară pentru controlul alimentelor si circumscriptia sanitară veterinară zonală, cu atributii în domeniul supravegherii si controlului sanitar-veterinar;

c) autoritate veterinară centrală - autoritatea veterinară centrală a României, reprezentată prin Agentia Natională Sanitară Veterinară din cadrul Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Pădurilor.

Art. 3. - Autoritatea veterinară competentă se va asigura că toate exploatatiile de animale producătoare de lapte corespund conditiilor stabilite în anexa care face parte integrantă din prezenta normă sanitară veterinară.

Art. 4. - Autoritatea veterinară centrală poate stabili conditii suplimentare de igienă în exploatatiile de animale producătoare de lapte.

 

ANEXĂ

la norma sanitară veterinară

 

CONDITII GENERALE

de igienă aplicabile în exploatatiile de animale producătoare de lapte

 

CAPITOLUL I

Conditii generale de igienă pentru spatiile de cazare a animalelor

 

Spatiile pentru cazarea animalelor vor îndeplini următoarele conditii de igienă:

1. spatiile în care sunt cazate animalele producătoare de lapte, precum si spatiile adiacente acestora trebuie să îndeplinească permanent conditiile constructive si să fie mentinute în conditii de curătenie si igienă corespunzătoare;

2. accesul în spatiile în care sunt cazate animalele producătoare de lapte, precum si în spatiile adiacente acestora trebuie să fie în permanentă stare de curătenie, fără acumulări de dejectii sau ape reziduale;

3. canalele de colectare a dejectiilor trebuie să fie curătate ori de câte ori este necesar;

4. grajdurile trebuie să fie mentinute uscate, dacă este necesar, prin folosirea unui asternut pentru animale;

5. spatiul pentru muls, spatiul destinat depozitării laptelui, spatiile de spălare si de depozitare, precum si echipamentele aferente acestor spatii trebuie să fie mentinute permanent în conditii de curătenie si igienă corespunzătoare;

6. dezinfectia spatiilor de cazare a animalelor si a spatiilor adiacente acestora se execută astfel încât operatiunea să nu prezinte risc de depreciere sau de contaminare a laptelui;

7. este interzisă cazarea altor specii de animale în spatiile de muls;

8. în spatiile în care sunt cazate animale, precum si în spatiile adiacente acestora toate insectele si animalele indezirabile vor fi combătute prin metode eficiente;

9. a) nu este permisă depozitarea substantelor chimice de orice natură, precum si a produselor biologice si medicamentoase în spatiile în care sunt cazate animale;

b) depozitarea substantelor chimice de orice natură, precum si a produselor biologice si medicamentoase se face în spatii special amenajate, cu acces restrictionat;

10. nu este permisă depozitarea furajelor si a alimentelor care pot influenta calitatea laptelui în spatiile în care sunt cazate animale.

 

CAPITOLUL II

Conditii generale de igienă a echipamentelor si instrumentelor folosite la muls si la manipularea laptelui

 

Echipamentele si instrumentele folosite la muls si la manipularea laptelui vor îndeplini următoarele conditii:

1. echipamentele si instrumentele trebuie să fie mentinute permanent în stare de întretinere bună si în conditii de igienă corespunzătoare;

2. echipamentele si instrumentele se curătă, se igienizează, se dezinfectează si se limpezesc cu apă potabilă, după care se depozitează într-un spatiu curat;

3. recipientele de depozitare a laptelui, după golire, igienizare si dezinfectare, se lasă cu unul dintre orificii deschis până la refolosire.

 

CAPITOLUL III

Conditii generale de igienă referitoare la muls

 

1. a) Fiecare animal trebuie să fie individualizat pentru a fi identificat de către autoritatea veterinară competentă.

b) Animalele trebuie să fie curate si bine întretinute.

c) Înaintea mulsului se face igiena glandei mamare si a zonelor adiacente acesteia, la fiecare animal.

2. Nu se permite nici o operatiune care ar putea avea efect nociv asupra laptelui, înainte si în timpul mulsului.

3. a) Înaintea mulsului efectiv operatorul inspectează aspectul laptelui, iar în cazul în care se constată modificări fizice ale acestuia, laptele va fi oprit de la livrare.

b) Animalele cu boli clinice ale glandei mamare se mulg, la terminarea mulsului, colectiv sau cu un echipament separat ori se mulg manual, iar laptele astfel obtinut se colectează separat si nu se livrează.

4. Animalele în lactatie, cu afectiuni ale glandei mamare, se tratează, numai după muls, cu substante cu actiune locală, spraiuri speciale sau în alt mod dispus de autoritatea competentă.

5. Personalul care efectuează mulsul si manipulează laptele trebuie să poarte echipament adecvat, conform normelor de igienă.

6. a) Personalul care execută mulsul trebuie să aibă mâinile curate în permanentă. Mâinile se vor spăla înainte si în timpul mulsului ori de câte ori este necesar.

b) În acest scop, în apropierea locului de desfăsurare a mulsului trebuie să existe facilităti pentru spălarea mâinilor si a bratelor.

c) Plăgile deschise si orice alte leziuni se acoperă cu pansamente rezistente la apă.

7. După muls laptele se depozitează într-un spatiu separat.

8. Spatiile pentru depozitarea laptelui trebuie să fie folosite numai pentru activităti legate de manipularea laptelui si echipamentelor de muls.

9. Pe durata stationării în spatiile de cazare a animalelor recipientele pentru lapte se acoperă sau se transportă în spatii special amenajate.

10. a) Dacă laptele este filtrat în timpul mulsului, filtrul utilizat se înlocuieste sau se curătă înainte de depăsirea capacitătii sale de filtrare, ori de câte ori este necesar.

b) La fiecare muls se utilizează un filtru nou.

c) Este interzisă utilizarea ca filtru a materialelor textile.